Les colonies de Pseudomonas aeruginosa isolées dans 20 des 30 laboratoires ont été repiquées pour obtenir des cultures pures, puis confirmées par identification bactérienne par MALDI-TOF. Le séquençage du génome complet (WGS) a été utilisé pour déterminer la relation entre ces colonies et la souche du site de fabrication. L’extraction de l’ADN génomique (ADNg) et la préparation de la bibliothèque NGS ont été réalisées. Après l’appel des bases, un typage séquentiel multilocus (MLST) a été réalisé pour 7 gènes de référence. Cette méthode MLST a été utilisée à la demande du client, afin de rester cohérent avec son approche antérieure, et 20/30 Labs a pu faciliter cette démarche. Un consensus a été établi entre les isolats ; l’isolat britannique a également été identifié comme étant Pseudomonas aeruginosa ST-17, confirmant ainsi l’origine du foyer épidémique. Ces informations ont été utilisées par la société de solutions médicales pour décider s’il fallait procéder à un nettoyage en profondeur et délocaliser le site de fabrication.
20/30 Labs est en mesure de fournir des résultats de séquençage du génome entier (WGS) dans des délais très courts, et nos rapports expliquent en détail ce que cela signifie pour le client. En abordant les études génomiques et moléculaires sous l’angle d’un microbiologiste, nous sommes les mieux placés non seulement pour fournir l’expertise hautement technique requise pour le WGS, mais aussi pour vous expliquer ce que les résultats signifient pour vous et votre cas de contamination.
— Farzana Sultana, 7 July 2023
Approche
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1.
Étape 1 : Objectif
Le client a fourni un ou plusieurs échantillons d’eau en vue d’un séquençage du génome entier (WGS).
20/30 Labs devait utiliser la plateforme Nanopore GridION, puis procéder à un typage séquentiel multilocus (MLST) sur le génome consensuel obtenu, afin de confirmer que l’organisme isolé est bien Pseudomonas aeruginosa ST-17, c’est-à-dire une colonisation provenant du site de fabrication.
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Étape 2 : Identification et isolement des colonies
Après filtration sur membrane et incubation, les échantillons ont présenté une croissance conforme aux attentes ; des colonies représentatives ont été prélevées et analysées à l’aide de la plateforme Bruker Microflex LT/SH MALDI-TOF. Le système MALDI-TOF est la solution optimale pour une identification bactérienne rapide et précise, et 20/30 Labs dispose d’une vaste bibliothèque personnalisée.
Par la suite, des colonies présentant des caractéristiques distinctives ont été isolées de la plaque d’échantillonnage et étalées pour obtenir des colonies isolées de culture pure, qui ont ensuite été utilisées pour l’extraction de l’ADN génomique (ADNg).
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3.
Étape 3 : Extraction de l’ADN génomique
L’extraction a été réalisée à l’aide du système Qiagen Genomic-tip, conformément aux instructions d’utilisation (IFU) de Nanopore (fabricant). À aucun moment, aucune fragmentation de l’ADNg n’a été effectuée.
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Étape 4 : Préparation de la bibliothèque NGS et séquençage.
Après l’extraction, la préparation de la bibliothèque NGS a été réalisée. L’ADN génomique extrait a été séquencé directement, sans amplification préalable par PCR. Pour ce faire, l’ADN génomique extrait a d’abord été normalisé, ses extrémités réparées, puis préparées en vue de la ligature des molécules adaptatrices Nanopore. 10 femtomoles de la bibliothèque préparée ont ensuite été immédiatement chargées dans une cellule de flux Nanopore et le séquençage a été lancé avec les paramètres de course spécifiques. L’application de séquençage a permis de générer 15,86 Gb de données de lecture, avec 1,12 million de lectures uniques. À l’issue de l’assemblage de novo du génome à l’aide de l’outil Flye Assembler, la profondeur moyenne de séquençage a été estimée à environ 1 800X.
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5.
Étape 5 : Typage séquentiel multilocus
Après l’identification des bases, un typage séquentiel multilocus (MLST) a été réalisé pour l’échantillon :
Les allèles de référence pour les sept gènes MLST de Pseudomonas aeruginosa fournis par le client (trpE, nuoD, aroE, acsA, guaA, ppsA, mutL) ont été téléchargés depuis pubmlst.org. L'outil krocus a ensuite été utilisé pour mapper les lectures de l'échantillon aux allèles de référence. Le type MLST de l'isolat a été déterminé en comparant les allèles présents avec la liste des profils MLST de Pseudomonas aeruginosa, téléchargée depuis pubmlst.org. -
6.
Étape 6 : Résultat
Un consensus a été établi entre les isolats ; l’isolat britannique a également été identifié comme étant Pseudomonas aeruginosa ST-17, ce qui confirme l’origine de l’épidémie.
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