De Pseudomonas aeruginosa-kolonies die in 20/30 laboratoria waren geïsoleerd, werden opnieuw uitgeplaat voor zuivere kweek en bevestigd met behulp van MALDI-TOF-bacteriële identificatie. Volledige genoomsequencing (WGS) werd gebruikt om de relatie tussen deze kolonies en de stam op de productielocatie vast te stellen. Er werd genomisch DNA (gDNA) geëxtraheerd en een NGS-bibliotheek werd voorbereid. Na de basebepaling werd Multi-Locus Sequence Typing (MLST) uitgevoerd voor 7 housekeeping-genen. Deze MLST-methode werd op verzoek van de klant gebruikt om consistent te blijven met hun eerdere aanpak, en 20/30 Labs kon dit faciliteren. Er werd overeenstemming gevonden tussen de isolaten, waarbij ook het Britse isolaat werd geïdentificeerd als Pseudomonas aeruginosa ST-17, wat een bron van de uitbraak bevestigde. Deze informatie werd door het bedrijf voor medische oplossingen gebruikt om te bepalen of de productielocatie grondig moest worden gereinigd en verplaatst.
20/30 Labs kan WGS met een zeer snelle doorlooptijd leveren, en onze rapporten bieden een gedetailleerde uitleg over wat dit voor de klant betekent. Door genomische en moleculaire onderzoeken te benaderen vanuit het perspectief van een microbioloog, zijn wij bij uitstek in staat om niet alleen de zeer technische expertise te bieden die vereist is voor WGS, maar ook om uit te leggen wat de resultaten betekenen voor u en uw besmettingsgeval.
— Farzana Sultana, 7 July 2023
Aanpak
-
1.
Fase 1: Doelstelling
De klant heeft een of meer watermonsters aangeleverd voor WGS.
20/30 Labs moest het Nanopore GridION-platform gebruiken, gevolgd door Multi-Locus Sequence Typing (MLST) op het geproduceerde consensusgenoom, om te bevestigen dat het geïsoleerde organisme Pseudomonas aeruginosa ST-17 is, d.w.z. kolonisatie afkomstig van de productielocatie.
-
2.
Fase 2: Identificatie en isolatie van kolonies
Na membraanfiltratie en incubatie vertoonden de monsters de verwachte groei; representatieve kolonies werden geselecteerd en geanalyseerd via het Bruker Microflex LT/SH MALDI-TOF-platform. Het MALDI-TOF-systeem is de optimale oplossing voor snelle en nauwkeurige bacteriële identificatie, en 20/30 Labs beschikt over een uitgebreide, op maat gemaakte bibliotheek.
Vervolgens werden kolonies met unieke kenmerken geïsoleerd van de monsterplaat en uitgezaaid tot zuivere culturen met afzonderlijke kolonies, die vervolgens werden gebruikt voor de extractie van genomisch DNA (gDNA).
-
3.
Fase 3: gDNA-extractie
De extractie werd uitgevoerd met behulp van het Qiagen Genomic-tip-systeem, volgens de gebruiksaanwijzing van Nanopore (fabrikant). Gedurende het gehele proces vond er geen fragmentatie van het gDNA plaats.
-
4.
Fase 4: Voorbereiding van de NGS-bibliotheek en sequentiebepaling.
Na de extractie werd de NGS-bibliotheek voorbereid. Het geëxtraheerde gDNA werd direct gesequenced, zonder voorafgaande PCR-amplificatie. Hiervoor werd het geëxtraheerde gDNA eerst genormaliseerd, de uiteinden gerepareerd en vervolgens voorbereid voor ligatie met de Nanopore-adaptermolculen. Vervolgens werd 10 femtomol van de geprepareerde bibliotheek onmiddellijk in een Nanopore-flowcel geladen en werd de sequentiebepaling gestart met de specifieke runparameters. De sequentiebepaling leverde 15,86 Gb aan leesgegevens op, met 1,12 miljoen unieke reads. Na de de novo-genoomassemblage met behulp van de Flye-assemblertool werd de gemiddelde sequentiediepte bepaald op ongeveer 1800X.
-
5.
Fase 5: Multi-Locus Sequence Typing
Na de basebepaling werd voor het monster Multi-Locus Sequence Typing (MLST) uitgevoerd:
De door de klant verstrekte referentie-allelen voor de zeven Pseudomonas aeruginosa MLST-genen (trpE, nuoD, aroE, acsA, guaA, ppsA, mutL) werden gedownload van pubmlst.org. Vervolgens werd de tool krocus gebruikt om de reads van het monster aan de referentie-allelen te koppelen. Het MLST-type van het isolaat werd bepaald door de aanwezige allelen te vergelijken met de lijst met MLST-profielen voor Pseudomonas aeruginosa, gedownload van pubmlst.org. -
6.
Fase 6: Resultaat
Er werd overeenstemming gevonden tussen de isolaten; het Britse isolaat werd eveneens geïdentificeerd als Pseudomonas aeruginosa ST-17, wat een uitbraakbeurs bevestigt.
Lees gerelateerde artikelen
20/30 biedt de volgende diensten aan:
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.