La préparation des échantillons et la chromatographie en phase liquide sont parfois négligées lors du développement et de la validation des méthodes LC-MS, compte tenu de la très grande sélectivité du Multiple Reaction Monitoring (MRM) dans les analyses LC-MS/MS. Pour obtenir une méthode robuste, il est toutefois nécessaire de prêter attention à toutes les étapes de la purification des échantillons et de la chromatographie. De plus, cette approche garantit la fiabilité et minimise la nécessité d’ajustements lors du passage d’une étude à l’autre, jusqu’au développement clinique.
Lors du développement et de la validation des méthodes LC-MS, on ne dispose généralement que d’informations limitées sur le métabolisme du médicament aux premiers stades du développement de celui-ci. Le médicament et son métabolite peuvent être traités de manière similaire dans le spectromètre de masse s’il est fortement métabolisé. Cela complique les choses, car le spectromètre de masse ne peut pas faire la distinction entre deux entités ayant la même masse et le même ion fils. C’est pourquoi la séparation de ces analytes par un test LC-MS/MS est essentielle pour éviter toute interférence due aux métabolites.
Le recours à la vaste gamme de protocoles de validation pour les méthodes LC-MS garantit la pérennité de la méthode, préserve sa crédibilité et réduit ainsi la nécessité de faire des concessions techniques lors du passage d’une étude clinique à une autre, en particulier au cours des phases de développement clinique.
En revanche, les méthodes de test ELISA ou les services d’immunoessais, bien que précieux dans certains contextes, peuvent ne pas offrir le même niveau de spécificité et de sélectivité que les analyses LC-MS/MS. Les immunoessais sont très sensibles à des antigènes ou anticorps spécifiques et s’avèrent utiles pour quantifier de grandes molécules telles que les protéines ou les peptides. Les services d’immunoessais peuvent toutefois ne pas convenir à la quantification de petites molécules telles que les médicaments et leurs métabolites, notamment dans des matrices biologiques complexes où la réactivité croisée et les interférences posent des problèmes. C’est pourquoi les analyses LC-MS/MS sont principalement utilisées en raison de leur capacité à fournir des données de quantification précises et fiables, particulièrement recherchées aux premiers stades du développement de médicaments, lorsque l’on dispose encore de peu d’informations sur le métabolisme du médicament.
Qualité et conformité
Conformément aux directives de la FDA, le développement et la validation d’une méthode LC-MS pour un test bioanalytique doivent inclure :
- i) la précision
- ii) l’exactitude
- iii) la sélectivité
- iv) la spécificité
- v) la stabilité
Nous disposons d’une expérience pratique et approfondie dans le développement et la validation de méthodes LC-MS/MS, acquise au cours de centaines d’études bioanalytiques conformes ou non aux bonnes pratiques de laboratoire (BPL). De plus, notre historique d’audits auprès des autorités réglementaires et des inspecteurs de nos clients est pratiquement irréprochable. Dès 2016, nous avons traité et répondu avec succès aux observations formulées lors des audits de la FDA. Enfin, nous accordons une grande importance à l’excellence scientifique et à la haute qualité, obtenues grâce à une combinaison minutieuse de chromatographie sélective et sensible et de spectrométrie de masse (test LC-MS/MS).
C’est pourquoi nous avons fait du développement de méthodes LC-MS/MS notre principal outil pour la réalisation de bioanalyses. Par ailleurs, nous ajoutons des méthodes de test ELISA et des services d’immunoanalyse à notre offre compétitive, ce qui renforce notre statut professionnel. Ces services complémentaires font partie intégrante de notre offre en tant qu’organisme de bioanalyse sous contrat, engagé à fournir des solutions sur mesure. Grâce à la synergie entre nos méthodes de test ELISA, des services d’immunoanalyse et de notre expertise en matière de développement et de validation des méthodes LC-MS, nous garantissons la solution globale requise pour relever les défis liés aux analyses de base, permettant ainsi à nos clients et à la communauté scientifique de compter sur la qualité des résultats et sur notre excellence.
Cas pratique
Dans ce cas, l’un de nos clients a sollicité notre aide pour le développement, l’optimisation et la validation d’une méthode LC-MS. Lors de l’analyse de l’échantillon, nous avons remarqué l’apparition d’un petit pic se présentant sous la forme d’un « épaulement » à côté du pic de l’analyte. L’analyte en question avait un temps de rétention de 1,5 minute. Notre approche expérimentale a permis d’allonger ce temps de rétention et de séparer le pic de l’analyte du matériel endogène qui éluait plus tôt, car la préparation de l’échantillon pour la LC-MS était basée sur la précipitation des protéines. Nous avons cherché à y parvenir en ajustant les conditions chromatographiques, notamment en utilisant une autre phase mobile et d’autres colonnes. Nos scientifiques ont confirmé qu’il ne s’agissait pas d’un pic divisé résultant d’une chromatographie incorrecte ou d’une interférence dans le plasma témoin, mais qu’il était plutôt dû à un autre composé présentant la même transition MS. Nous avons donc émis l’hypothèse et commencé à examiner si ce problème était dû à un métabolite présentant une transition similaire.
Au cours de cette étude, nous avons également examiné la possibilité de recourir à une méthode de test ELISA ou à des services d’immunoanalyse en complément du test LC-MS/MS. Ces méthodes pourraient offrir une spécificité et une sensibilité accrues, notamment pour la détection et la quantification de l’analyte cible et des composés susceptibles d’interférer. Nous avons toutefois donné la priorité, dans un premier temps, à l’optimisation du développement de la méthode LC-MS afin de remédier à l’interférence entre les pics observée, car cette méthode permettait la quantification et l’identification directes de l’analyte et des métabolites potentiels. Néanmoins, dans le cadre d’études futures, il pourrait être envisagé de recourir à des techniques complémentaires, telles que la méthode ELISA ou les services d’immunoanalyse, afin d’améliorer la robustesse analytique et la précision de l’analyse.
La validation de la méthode LC-MS et la préparation des échantillons pour la LC-MS constituent des éléments essentiels de notre approche visant à garantir la fiabilité et la précision de nos méthodes d’analyse.
Lors de la séparation des deux pics dans le cadre de la validation de la méthode LC-MS, nous avons constaté que l’intensité du pic parasite variait d’un échantillon à l’autre. Il en est ressorti que ce bruit provenait d’un métabolite. Nous avons par ailleurs estimé que ce métabolite était un conjugué glucuronide, car le pic en question éluait plus tôt que les analytes. Nous ne disposions toutefois pas, à ce moment-là, d’un étalon de référence pour le glucuronide. Nous avons finalement confirmé que ce pic correspondait bien à un conjugué glucuronide, après avoir analysé les échantillons de plasma par hydrolyse enzymatique. Nous avons ainsi validé avec succès la méthode et l’avons appliquée à l’analyse d’échantillons de plasma.
Bien que nous nous soyons concentrés sur le développement, l’optimisation et la validation de méthodes LC-MS, nous proposons également des services dans le domaine du développement de méthodes de test ELISA et d’immunoessais afin de répondre aux divers besoins de nos clients en matière de recherche bioanalytique.
Conclusion
Le conjugué glucuronide de l’analyte était présent dans les échantillons cliniques et la séparation chromatographique s’est avérée essentielle pour éviter cette interférence.
Le développement et la validation de méthodes LC-MS/MS constituent d’excellents outils pour garantir la sélectivité, mais nous ne devons faire aucune concession en matière de purification des échantillons et de séparation chromatographique. Il faut prévoir un temps de rétention suffisant pour séparer les composés endogènes à élution précoce et les métabolites de l’analyte.
NorthEast Biolab propose une gamme complète de services bioanalytiques, notamment :
- Développement, validation et analyse de méthodes cliniques LC-MS/MS
- Assistance bioanalytique non clinique pour la LC-MS/MS, y compris les études de plage de dosage (DRF)
- Développement, validation et analyse de méthodes toxicologiques conformes aux BPL
Outre le développement et la validation de méthodes LC-MS/MS, nous proposons également le développement de méthodes de test ELISA et des services d’immunoanalyse. Notre équipe suit des procédures opérationnelles standard (SOP) pour le développement, l’optimisation et la validation des méthodes bioanalytiques. Nous révisons et mettons à jour régulièrement ces SOP afin de respecter la réglementation et les attentes de nos clients, et de fournir des données fiables et de haute qualité.
Lors du développement de méthodes LC-MS, nous accordons la priorité à une séparation chromatographique robuste afin d’éviter les interférences, telles que le métabolite conjugué au glutacuronide. Nos processus de développement et de validation des méthodes LC-MS garantissent une quantification précise et fiable des analytes dans des matrices complexes. De plus, nous sommes spécialisés dans les techniques de préparation d’échantillons pour la LC-MS afin d’augmenter la sensibilité et de minimiser les effets de matrice, ce qui permet en fin de compte d’optimiser les performances de la méthode et la qualité des données.
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Enregistré et inspecté par diverses autorités réglementaires
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