Les agents chimiopréventifs visant à réduire les effets des composés génotoxiques présentent un intérêt particulier. Lorsque ces composés réagissent avec l’ADN, ils forment des modifications covalentes, également appelées adduits d’ADN, qui peuvent altérer la structure et la fonction de l’ADN. Pour comprendre le rôle des adduits d'ADN dans l'apparition et la progression des maladies, il est important de les doser dans des échantillons biologiques tels que le sang, l'urine ou les tissus. Tel est l’objectif de l’adductomique de l’ADN, un nouveau domaine de recherche qui utilise la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour rechercher de manière exhaustive et impartiale des adduits d’ADN connus et inconnus.
L’adductomique de l’ADN représente toutefois un défi, en particulier lorsqu’elle est appliquée à des échantillons in vitro à base de cellules, fréquemment utilisés pour étudier les effets des composés génotoxiques sur différents types de cellules. Parmi ces défis figurent notamment la faible quantité et la qualité de l’ADN disponible à partir de cellules cultivées, les interférences dues à des composants de la culture cellulaire tels que les protéines sériques et les additifs du milieu de culture, ainsi que le besoin d’étalons de référence et de bibliothèques spectrales pour l’analyse des adduits d’ADN.
Solution
Pour relever ces défis, nous avons développé, validé et appliqué une méthode LC–MS/MS afin d’analyser les adduits d’ADN dans des échantillons in vitro à base de cellules. La méthode comprenait les étapes suivantes :
- Isolation de l’ADN à partir de cellules cultivées à l’aide d’un kit disponible dans le commerce, garantissant un rendement et une pureté élevés de l’ADN
- Hydrolyse enzymatique de l’ADN en nucléosides, ce qui a permis de réduire la complexité de l’échantillon et d’augmenter la sensibilité de l’analyse
- Extraction en phase solide en ligne et séparation des nucléosides par chromatographie en phase inverse, ce qui a permis d’éliminer les interférences dues aux composants de la culture cellulaire et d’obtenir une bonne résolution des analytes
- Détection et identification des adduits d’ADN à l’aide d’un spectromètre de masse à haute résolution fonctionnant en mode d’ionisation par électrospray positif (ESI+) et en mode d’acquisition indépendante des données (DIA), ce qui a permis l’acquisition simultanée des spectres précurseurs et des spectres de fragmentation pour tous les analytes
La méthode a été qualifiée selon l’approche « Fit-for-Purpose », les performances de la méthode ayant été évaluées sur la base de l’usage prévu et de critères d’acceptation prédéfinis. La méthode a présenté des caractéristiques de performance acceptables en termes d’exactitude, de précision, de linéarité, de sélectivité et de stabilité lors de la détection et de la quantification d’adduits d’ADN dans des échantillons in vitro à base cellulaire.
La méthode a été appliquée à l’analyse d’adduits d’ADN formés par divers composés génotoxiques, notamment le benzo[a]pyrène, l’aflatoxine B1 et l’acétaldéhyde, dans différentes lignées cellulaires telles que HepG2, A549 et TK6, représentant divers organes et tissus.
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Résultat
Cette méthode s’est révélée être un outil sensible et fiable pour l’analyse des adduits d’ADN dans des échantillons in vitro à base de cellules et a permis d’étudier la réparation des adduits d’ADN ainsi que leur formation dans différents modèles cellulaires. Cette méthode a également contribué aux progrès de l’adductomique de l’ADN en fournissant de nouvelles données et connaissances sur la présence et la diversité des adduits d’ADN dans les systèmes biologiques.
Cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les mécanismes et les conséquences des dommages à l’ADN causés par des composés génotoxiques, ainsi que pour évaluer l’efficacité et la sécurité d’agents chimiopréventifs tels que les antioxydants, les polyphénols et les composés phytochimiques, susceptibles d’influencer la formation et la réparation des adduits d’ADN. Cette méthode pourrait également être appliquée à d’autres échantillons biologiques, tels que les tissus humains ou les fluides corporels, afin d’évaluer l’exposition aux lésions de l’ADN et le risque associé au sein des populations humaines. Cette approche globale combine l’analyse des adduits à l’ADN, la recherche en adductomique de l’ADN et l’évaluation des agents chimiopréventifs, et fournit des informations précieuses sur les mécanismes sous-jacents aux lésions de l’ADN ainsi que sur les stratégies possibles de prévention et d’intervention.
Enregistré et contrôlé par diverses autorités de régulation
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