En raison de leur structure complexe, ces médicaments sont difficiles à séparer et à détecter à l’aide des méthodes d’analyse conventionnelles. Leur faible stabilité signifie qu’ils peuvent se dégrader ou perdre leur activité pendant la préparation des échantillons, le stockage ou l’analyse. Leur forte sensibilité aux interférences matricielles implique que la présence de composés exogènes ou endogènes dans les échantillons biologiques peut affecter l'exactitude et la précision de la mesure. Il est donc nécessaire de disposer d’une méthode d’analyse sensible, sélective et robuste, capable de surmonter ces défis et de quantifier avec précision les peptides liés à des charges utiles dans des échantillons de plasma.
Solution
Une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC–MS/MS) a été mise au point pour analyser un peptide lié à une ogive dans le plasma de rats, de primates non humains (NHP) et d’êtres humains. La méthode comprenait une étape simple de précipitation des protéines, suivie d’une séparation chromatographique et d’une détection à l’aide d’un spectromètre de masse à triple quadripôle. Un peptide marqué aux isotopes stables a été utilisé comme étalon interne (IS) afin de corriger les pertes de l’analyte et les effets de matrice.
L'étape de précipitation des protéines a été réalisée en ajoutant de l'acétonitrile aux échantillons de plasma. Cela a entraîné la précipitation des protéines et d'autres substances interférentes, tandis que le peptide lié à la tête de warhead et l'étalon interne sont restés dans le surnageant. Le surnageant a ensuite été injecté dans le système LC–MS/MS, où le peptide lié à la tête de fusée et l’étalon interne (IS) ont été séparés sur une colonne C18 en phase inverse à l’aide d’une élution en gradient d’eau et d’acétonitrile, tous deux contenant 0,1 % d’acide formique.
La détection a été effectuée à l’aide du spectromètre de masse en mode d’ionisation par électrospray positif (ESI+), en recourant à la surveillance de réactions multiples (MRM) des précurseurs et des produits du peptide lié à la tête de warhead ainsi que de l’étalon interne. Les transitions MRM ont été optimisées afin d’obtenir la sensibilité et la spécificité maximales pour l’analyte et l’étalon interne. Le protocole mis au point a été conçu pour offrir un test robuste, reproductible et sensible, adapté à la quantification des peptides chez plusieurs espèces animales et destiné à soutenir les études bioanalytiques dans le cadre du développement préclinique et clinique de médicaments.
Résultat
La méthode LC–MS/MS pour le peptide a été validée avec succès conformément aux directives de la FDA américaine relatives à la validation des méthodes bioanalytiques. Le test a démontré une excellente linéarité, exactitude, précision, sélectivité, sensibilité, récupération et stabilité pour le peptide lié à la « warhead » dans le plasma de rats, de primates non humains et d’humains.
Les courbes d’étalonnage étaient linéaires sur la plage de concentrations comprise entre 0,5 et 500 ng/mL, avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99. L'exactitude et la précision de la méthode répondaient aux critères d'acceptation de ± 15 % pour les échantillons de contrôle qualité et de ± 20 % pour la limite inférieure de quantification du peptide. La sélectivité de la méthode a été démontrée par l’absence de toute interférence significative provenant d’échantillons de plasma vierges ou d’échantillons de plasma auxquels d’autres médicaments avaient été ajoutés, y compris des matrices issues d’études menées sur des primates non humains.
La sensibilité de la méthode était suffisante pour quantifier le peptide lié à la « warhead » à la limite inférieure de quantification de 0,5 ng/mL. Le taux de récupération était constant et reproductible, avec des valeurs comprises entre 85 % et 95 % pour le peptide lié à la tête de charge et entre 90 % et 100 % pour l’étalon interne. La stabilité a été confirmée dans diverses conditions de stockage et de manipulation, notamment lors de cycles de congélation-décongélation, de stockage à court et à long terme et de stockage après préparation, sans qu’aucune dégradation significative n’ait été observée.
La méthode validée a été appliquée avec succès pour étayer des études pharmacocinétiques dans des contextes tant précliniques que cliniques. La méthode a démontré son utilité et sa fiabilité pour la quantification des peptides dans des échantillons de plasma et a fourni des informations précieuses pour l’évaluation de la sécurité, de l’efficacité et des propriétés pharmacologiques du médicament. De plus, la stratégie expérimentale LC–MS/MS s’est révélée être une plateforme robuste pour l’analyse quantitative des peptides, des protéines et des métabolites associés, garantissant ainsi des résultats précis et reproductibles dans toutes les matrices étudiées.
Enregistré et inspecté par diverses autorités réglementaires
Contactez notre chercheur pour vos besoins en matière de quantification de peptides, d'analyse LC-MS de peptides et de pharmacocinétique des peptides
Articles connexes
MSD Hybridization ELISA PK Immunoassay Development, GLP Validation, And Oligonucleotide Analysis
TaqMan Gene Expression Assay, Copy Number Variation Assay Development, nGLP Validation, And Sample Analysis
Genomic Variation Analysis – TaqMan Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Analysis
LC MS Bioanalysis Of Antisense Oligonucleotide (ASO) Using Mass Spectrometry And Ion Pair Chromatography
LC MS Method For Proline Amino Acid, Hydroxyproline In Mouse Tissues
LC MS Method For DNA Adducts Analysis In Cell-Based In-Vitro Samples
LC MS Method for Everolimus Eluting Coronary Stent Drug Delivery Systems
Mass Spectrometry Amino Acids, Quantitative LC MS Amino Acid Analysis
LC MS Method Development And GLP Validation For Human Plasma PK Sample Analysis
Incurred Sample Reanalysis (ISR) Test, FDA Requirements, And Study Evaluation
Dried Blood Spot (DBS) Sampling, DBS Collection, And DBS Analysis
Articles connexes
Test multiplex pour les biomarqueurs inflammatoires, validation GLP des cytokines, quantification des cytokines sur MSD
Développement d'un test immunologique ELISA PK par hybridation MSD, validation GLP et analyse d'oligonucléotides
Test d'expression génique TaqMan, développement d'un test de variation du nombre de copies, validation nGLP et analyse d'échantillons
Analyse des variations génomiques – Analyse des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) par TaqMan
Bioanalyse par LC-MS d'oligonucléotides antisens (ASO) à l'aide de la spectrométrie de masse et de la chromatographie par paires d'ions
Analyse par LC-MS de l'épigallocatéchine gallate (EGCG) dans le sérum humain VcEDTA
Méthode LC-MS pour la détermination de la proline et de l'hydroxyproline dans les tissus de souris
Méthode LC-MS pour l'analyse des adduits d'ADN dans des échantillons in vitro d'origine cellulaire
Méthode LC-MS pour les systèmes de libération de médicaments avec des stents coronariens libérant de l'évérolimus
Spectrométrie de masse des acides aminés, analyse quantitative des acides aminés par LC-MS
Développement d'une méthode LC-MS et validation GLP pour l'analyse d'échantillons plasmatiques pharmacocinétiques
Test de réanalyse des échantillons collectés (ISR), exigences de la FDA et évaluation de l'étude
Prélèvement, collecte et analyse de gouttes de sang séché (DBS)
Votre partenaire en matière de qualité, de sécurité et de conformité
Le secteur des sciences de la vie exige des connaissances spécialisées et un accompagnement fiable. Grâce à notre vaste expertise, nous aidons les organisations à se conformer à la législation et à la réglementation, à garantir la qualité et à continuer d'innover en toute confiance.