La concentration des acides aminés proline et hydroxyproline dans des échantillons biologiques, tels que le sang, l’urine ou les tissus, peut refléter l’état du métabolisme du collagène et son renouvellement, et peut servir d’indicateur d’états physiologiques et pathologiques, tels que le vieillissement, l’inflammation et le cancer. L'analyse de la proline et de l'hydroxyproline dans les tissus de souris pose toutefois plusieurs défis analytiques, tels que la faible concentration de ces acides aminés dans la matrice tissulaire, la polarité élevée de ces acides aminés, qui les rend difficiles à retenir et à séparer par chromatographie en phase inverse conventionnelle, l’interférence d’autres acides aminés et des formes de proline et d’hydroxyproline liées à des peptides, susceptibles d’affecter la précision et la spécificité de la mesure,
ainsi que la présence de concentrations endogènes variables de proline et d’hydroxyproline dans divers tissus, tels que le foie, les reins, les poumons et le cœur, ce qui complique encore davantage la quantification précise. Il est donc nécessaire de disposer d’une méthode sensible, sélective et fiable pour quantifier la proline et l’hydroxyproline dans les tissus murins, ce qui pourrait contribuer à élucider le rôle et la régulation de ces acides aminés dans la synthèse et la dégradation du collagène, ainsi que leur implication dans divers processus pathologiques. À cet égard, la chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) offre une approche prometteuse en raison de sa
Solution
Pour relever ces défis, nous avons développé et validé une méthode basée sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC–MS/MS) pour la quantification de la proline et de l’hydroxyproline dans les tissus murins. La méthode comprenait les étapes suivantes :
- Homogénéisation du tissu et hydrolyse acide de celui-ci, permettant de libérer les acides aminés libres de la matrice tissulaire ainsi que les formes de proline et d’hydroxyproline liées aux peptides
- Une étude en fonction du temps, permettant de déterminer la durée d’hydrolyse optimale pour chaque type de tissu en fonction de la récupération maximale des acides aminés à base de proline et de l’hydroxyproline
- Précipitation des protéines à l’acétonitrile, permettant d’éliminer les protéines et autres substances interférentes de l’hydrolysat
- Dilution du surnageant avec de l’eau, ce qui a permis d’ajuster la composition du solvant et la concentration des analytes en vue de leur injection dans le système LC–MS/MS ;
- Séparation chromatographique sur une colonne HILIC (chromatographie liquide à interaction hydrophile), au cours de laquelle les acides aminés polaires ont été retenus et séparés par une élution en gradient d’acétonitrile et d’eau contenant 0,1 % d’acide formique
- Détection et quantification de l'acide aminé proline et de l'hydroxyproline à l'aide d'un spectromètre de masse fonctionnant en mode d'ionisation par électrospray positif et en mode de surveillance des réactions multiples (MRM), ce qui a permis de sélectionner et de mesurer les ions précurseurs et de production spécifiques à chaque analyte
- Utilisation d'un mélange d'acides aminés comme étalon interne, permettant de compenser l'effet de matrice et la variabilité liées à la préparation des échantillons et à l'analyse, ce qui a permis d'obtenir un étalon interne unique reflétant fidèlement les variations de concentration des deux analytes et présentant une réponse linéaire en fonction de la concentration en proline et en hydroxyproline.
Notre approche globale garantit ainsi une quantification précise et fiable de la proline, permettant de surmonter les difficultés liées à l’analyse de ces acides aminés dans les tissus murins. L’hypothèse est que les perturbations de la synthèse du collagène, souvent caractérisées par des modifications du métabolisme de la proline et de l’hydroxyproline, sont associées à des pathologies invalidantes, notamment la fibrose et les maladies du tissu conjonctif. Grâce à la précision de notre méthode de mesure de ces acides aminés, les chercheurs peuvent approfondir leur compréhension des mécanismes sous-jacents des maladies liées au collagène et explorer des interventions thérapeutiques potentielles visant à influencer les voies de synthèse du collagène, afin de soulager la souffrance humaine.
Résultats
La méthode a été validée conformément aux directives de la Food and Drug Administration (FDA) américaine relatives aux méthodes bioanalytiques et a démontré une bonne exactitude, précision, linéarité, précision, sélectivité, récupération, effet de matrice et stabilité lors de la mesure de la proline et de l’hydroxyproline dans des tissus de souris, composants essentiels à la synthèse du collagène. La méthode a utilisé la chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) comme technique de séparation robuste. Cette approche chromatographique a permis d’obtenir une excellente résolution et une forme de pic optimale pour la proline et l’hydroxyproline, ce qui a permis une quantification précise.
Cette technique a été utilisée pour étudier la variation des concentrations des acides aminés libres, la proline et l’hydroxyproline, dans différents tissus pulmonaires de souris – notamment des tissus normaux, inflammatoires, fibrotiques et tumoraux –, la chromatographie liquide à interaction hydrophile ayant été employée pour assurer une bonne séparation des composés. Cette technique chromatographique a constitué notre principal outil pour détecter les acides aminés proline et hydroxyproline à des concentrations micromolaires. La sensibilité et la pertinence de la HILIC pour l’analyse de ces analytes dans des biomatrices complexes ont également été démontrées.
La méthode a mis en évidence des différences significatives dans la concentration et le rapport entre la proline et l’hydroxyproline entre différents types de tissus, ce qui suggère des modifications du métabolisme et du renouvellement du collagène dans divers tableaux cliniques. La méthode de dosage de la proline pourrait contribuer à l’étude du rôle et de la régulation de l’acide aminé proline et de l’hydroxyproline dans des modèles murins de diverses maladies, telles que les inflammations, la fibrose et le cancer, ainsi qu’à évaluer l’effet des interventions thérapeutiques sur la synthèse et la dégradation du collagène. La méthode de dosage de la proline pourrait également être étendue à d’autres types de tissus, tels que le foie, les reins et le cœur, ainsi qu’à d’autres échantillons biologiques, tels que le sang et l’urine, afin d’évaluer l’exposition à la proline et à l’hydroxyproline, ainsi que les risques associés, au sein de populations de souris.
Enregistré et contrôlé par diverses autorités réglementaires
Contactez notre chercheur pour le développement de votre test immunologique PK-ELISA à base de fragments d'anticorps monoclonaux, la validation GLP et la bioanalyse des anticorps monoclonaux (MAb)
Articles connexes
MSD Hybridization ELISA PK Immunoassay Development, GLP Validation, And Oligonucleotide Analysis
TaqMan Gene Expression Assay, Copy Number Variation Assay Development, nGLP Validation, And Sample Analysis
Genomic Variation Analysis – TaqMan Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Analysis
LC MS Bioanalysis Of Antisense Oligonucleotide (ASO) Using Mass Spectrometry And Ion Pair Chromatography
Epigallocatechin Gallate (EGCG) LC MS Method Development, GLP Validation, And Sample Analysis In VcEDTA Human Serum
LC MS Method For DNA Adducts Analysis In Cell-Based In-Vitro Samples
LC MS Method for Everolimus Eluting Coronary Stent Drug Delivery Systems
Mass Spectrometry Amino Acids, Quantitative LC MS Amino Acid Analysis
LC MS Method Development And GLP Validation For Human Plasma PK Sample Analysis
Incurred Sample Reanalysis (ISR) Test, FDA Requirements, And Study Evaluation
Dried Blood Spot (DBS) Sampling, DBS Collection, And DBS Analysis
Articles connexes
Test multiplex pour les biomarqueurs inflammatoires, validation GLP des cytokines, quantification des cytokines sur MSD
Développement d'un test immunologique ELISA PK par hybridation MSD, validation GLP et analyse d'oligonucléotides
Test d'expression génique TaqMan, développement d'un test de variation du nombre de copies, validation nGLP et analyse d'échantillons
Analyse des variations génomiques – Analyse des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) par TaqMan
Bioanalyse par LC-MS d'oligonucléotides antisens (ASO) à l'aide de la spectrométrie de masse et de la chromatographie par paires d'ions
Analyse par LC-MS de l'épigallocatéchine gallate (EGCG) dans le sérum humain VcEDTA
Méthode LC-MS pour la détermination de la proline et de l'hydroxyproline dans les tissus de souris
Méthode LC-MS pour l'analyse des adduits d'ADN dans des échantillons in vitro d'origine cellulaire
Méthode LC-MS pour les systèmes de libération de médicaments avec des stents coronariens libérant de l'évérolimus
Spectrométrie de masse des acides aminés, analyse quantitative des acides aminés par LC-MS
Développement d'une méthode LC-MS et validation GLP pour l'analyse d'échantillons plasmatiques pharmacocinétiques
Test de réanalyse des échantillons collectés (ISR), exigences de la FDA et évaluation de l'étude
Prélèvement, collecte et analyse de gouttes de sang séché (DBS)
Votre partenaire en matière de qualité, de sécurité et de conformité
Le secteur des sciences de la vie exige des connaissances spécialisées et un accompagnement fiable. Grâce à notre vaste expertise, nous aidons les organisations à se conformer à la législation et à la réglementation, à garantir la qualité et à continuer d'innover en toute confiance.