Avant le dosage, les TA ont été préparés dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), ce qui a nécessité l'utilisation d'étalons d'extraction et d'étalonnage purs, ainsi que de contrôles qualité (CQ). Le défi consistait à développer et à valider une méthode HPLC-UV unique permettant de séparer et de quantifier simultanément tous les TA et leurs impuretés potentielles dans différentes formulations, puis à appliquer cette méthode pour analyser les TA présents dans la formulation. Cela a nécessité la mise au point d’une méthode HPLC garantissant une analyse exacte et précise.
La méthode établie a ensuite été appliquée pour analyser les TA dans la formulation, ce qui a souligné l’importance du développement de méthodes d’analyse HPLC-UV robustes pour l’analyse pharmaceutique. Lors du développement de la méthode chromatographique, on a eu recours à la lution en gradient pour améliorer la résolution et la sensibilité, ce qui a une nouvelle fois mis en évidence la supériorité de la HPLC-UV par rapport à la spectrophotométrie UV dans les analyses pharmaceutiques complexes, comme l’a encore démontré la comparaison entre la HPLC et la spectrophotométrie UV. Le chromatogramme HPLC-UV a été utilisé pour évaluer la pureté des pics et la résolution des analytes.
Solution
Une approche systématique a été suivie pour le développement et la validation de la méthode HPLC-UV, conformément aux lignes directrices du Conseil international d’harmonisation (ICH). Au cours du développement de la méthode HPLC, les conditions chromatographiques, telles que le type de colonne, la composition de la phase mobile, le pH, le débit et la longueur d’onde de détection, ont été optimisées à l’aide d’une stratégie de conception d’expériences (DOE) afin de produire des chromatogrammes HPLC-UV de haute qualité. Le recours à la lution en gradient a permis d’améliorer encore la robustesse et l’efficacité de la méthode d’analyse HPLC-UV afin de garantir une séparation et une résolution optimales des analytes, ce qui a donné lieu à des chromatogrammes HPLC-UV clairs et bien définis. Cette approche démontre les avantages de la HPLC par rapport à la spectrophotométrie UV en offrant une résolution et une spécificité supérieures en analyse pharmaceutique.
La validation de la méthode HPLC-UV a porté sur les paramètres de performance de la méthode, tels que la spécificité, la linéarité, l’exactitude, la précision, la robustesse, la limite de détection et la limite de quantification. La méthode d’analyse HPLC-UV a été validée pour chaque TA et les impuretés associées dans la matrice de formulation concernée. La méthode a également été testée quant à son applicabilité aux études de stabilité des TA dans la formulation. L’intégration de la lution en gradient dans le développement de la méthode HPLC a ainsi permis de créer un cadre analytique complet et fiable, répondant aux exigences strictes de l’analyse pharmaceutique. Cela souligne l’importance du recours à la HPLC par rapport à la spectrophotométrie UV pour obtenir des résultats précis et fiables dans la recherche et le développement pharmaceutiques.
Résultat
Une méthode HPLC-UV robuste et fiable a été mise au point et validée pour analyser simultanément cinq TA. Le développement de la méthode HPLC a été crucial pour atteindre cet objectif et a permis une séparation et une détection optimales des analytes. En raison des structures et des temps de rétention similaires des deux séries de TA, la validation de la méthode d’analyse HPLC-UV a été divisée en deux validations utilisant les mêmes paramètres. L’une des validations portait sur deux échantillons d’essai, tandis que l’autre a été réalisée avec les trois autres TA. La méthode a permis d’obtenir, en moins de 10 minutes, une bonne séparation de tous les analytes à une longueur d’onde de 254 nm, à l’aide d’une colonne Agilent XDB-C18 et d’une élution en gradient d’acétonitrile : méthanol (1:1) contenant 0,1 % d’acide formique et de l’eau acidifiée à 0,1 % d’acide formique. Cette stratégie de lution en gradient a permis une séparation efficace des analytes cibles en un temps de course court de 10 minutes, garantissant ainsi une quantification et une détection précises. La lution en gradient est connue pour améliorer la résolution chromatographique en faisant varier la composition de la phase mobile au fil du temps. Le chromatogramme HPLC-UV présentait des pics distincts pour chaque analyte, ce qui confirmait la séparation et la détection réussies des composés cibles.
La méthode d’analyse HPLC-UV s’est révélée précise et exacte, avec des taux de récupération compris entre 95 et 105 % et des écarts-types relatifs inférieurs à 5 % pour tous les analytes. La méthode s’est révélée robuste, sans variations significatives des résultats dans différentes conditions expérimentales. Par rapport à la spectrophotométrie UV, la HPLC a fait preuve d’une précision et d’une exactitude supérieures, ce qui a renforcé la fiabilité des résultats obtenus. La méthode HPLC mise au point s’est révélée sensible, avec des limites de détection et de quantification comprises entre 50,00 et 300,00 μg/mL pour tous les analytes.
La méthode a été appliquée avec succès pour l'étude de stabilité des TA dans la formulation à température ambiante et à -70 °C pendant une durée maximale de 10 jours, et les résultats étaient conformes aux spécifications. Le chromatogramme HPLC-UV a en outre confirmé la spécificité et la fiabilité de la méthode. La méthode HPLC-UV a démontré sa polyvalence et son efficacité dans l’analyse de cinq TA et de leurs impuretés dans différentes formulations ; elle peut être utilisée à des fins de contrôle qualité et de conformité réglementaire.
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