La validation des méthodes dans les études pharmacocinétiques et bioanalytiques garantit des résultats de haute qualité en réduisant au minimum les biais et les erreurs. Le processus de validation comprend l’évaluation de la sélectivité, de la spécificité, de la sensibilité, de l’exactitude, de la précision, de la récupération et de la stabilité de l’analyte. Nous réalisons ces validations sur des échantillons de contrôle qualité (échantillons CQ) préparés en enrichissant une matrice exempte de médicament, provenant de volontaires humains ou d’animaux, avec un composé de référence dont l’identité et la concentration sont connues.
Cependant, pour diverses raisons, les échantillons de contrôle qualité ne reproduisent pas toujours l’activité du composé testé dans les échantillons étudiés. Par exemple, en raison d’un manque de récupération du composé, d’une hétérogénéité de l’échantillon, de la présence de métabolites, de la liaison aux protéines et d’effets de suppression de la matrice, etc. Dans ce contexte, la réanalyse des échantillons réels (ISR) revêt une importance cruciale. Un test ISR consiste à réanalyser les échantillons réels afin de garantir la précision et la fiabilité des résultats de l’analyse initiale.
Réglementation
Les premières discussions sur la nécessité de lignes directrices relatives à la réanalyse des échantillons incurrés – motivées par la grande variabilité des échantillons réanalysés par rapport aux résultats initiaux dans certaines études, telle qu’observée par la FDA – ont eu lieu en mai 2006 lors de l’atelier bioanalytique AAPS/FDA intitulé « Validation et mise en œuvre des méthodes bioanalytiques quantitatives : meilleures pratiques pour les dosages chromatographiques et de liaison aux ligands ». Par la suite, des représentants éminents de l’industrie se sont réunis en février 2008 pour discuter des procédures générales de réanalyse des échantillons altérés lors de l’atelier bioanalytique AAPS/FDA intitulé « Atelier de l’AAPS sur les thèmes d’actualité en bioanalyse GLP : reproductibilité des essais sur des échantillons altérés – implications des recommandations de Crystal City », puis a publié en juin 2009 des attentes concernant la réalisation, la documentation et la communication des résultats des essais ISR. L’Agence européenne des médicaments (EMA) a été la première à publier des lignes directrices réglementaires concernant l’analyse ISR. La FDA a emboîté le pas en 2013 avec la publication de son propre projet de document.
Le mandat de la FDA en matière d’ISR
- Exige la réanalyse des échantillons obtenus (ISR) pour toutes les études PK/PD et BE in vivo cruciales chez l’homme ; l’ISR doit être effectuée au moins une fois par méthode et par espèce animale au cours des études de sécurité non cliniques
- Intégrer l’analyse ISR dès la phase pilote du développement et de la validation de la méthode afin de permettre la mise en place de mesures correctives avant l’étude cruciale ; vérifier la réanalyse des échantillons existants en plus grand nombre et avec une plus grande variabilité pour les études PK/PD cruciales
- Sélectionner au maximum 10 % des échantillons d’étude pour le test ISR
- Sélectionner les échantillons de manière à couvrir de manière adéquate l’ensemble du profil PK/PD de tous les sujets, y compris les évaluations à des moments proches de la Cmax et de la fin de la phase d’élimination
- Effectuer l’analyse à l’aide de la méthode bioanalytique d’origine (y compris le nombre de répétitions et les facteurs de dilution éventuellement appliqués), et comparer les échantillons réanalysés à des échantillons d’étalonnage fraîchement préparés
- Au moins deux tiers (67 %) des résultats des tests ISR doivent se situer à moins de 20 % des résultats initiaux pour les petites molécules et à moins de 30 % des résultats initiaux pour les grandes molécules ; la différence en pourcentage est calculée comme suit : (répétition – résultat initial) * 100 / moyenne
- Il n’existe aucune obligation légale de procéder à des analyses complémentaires si un échantillon individuel ne répond pas aux critères d’acceptation ci-dessus ; en cas de différence significative, un avis scientifique est attendu
- Interrompez les analyses, menez une enquête et documentez-la si la réanalyse des échantillons utilisés ne satisfait globalement pas aux critères d’acceptation
- Documenter toutes les évaluations des tests ISR afin de pouvoir retracer le déroulement de l’étude et des éventuelles études de suivi
Étude
Nous avons réalisé une analyse ISR sur la capécitabine, un médicament de chimiothérapie utilisé dans le traitement de nombreux types de cancer, tels que les cancers du sein, du côlon, du rectum, de l’estomac, de l’œsophage et du pancréas. Ce médicament est un promédicament de 5-fluorouracile (FU) conçu de manière rationnelle, qui imite la perfusion continue de 5-FU tout en évitant les complications et les inconvénients liés à l’administration intraveineuse. Cet antimétabolite est absorbé sous forme inchangée par le tractus gastro-intestinal, transformé par voie enzymatique en 5-FU actif et libéré directement dans la tumeur. C’est pourquoi une mesure précise du 5-FU par réanalyse des échantillons utilisés constitue un élément essentiel de cette étude.
Nous avons mesuré à la fois la capécitabine et son métabolite, le 5-FU. Pour la préparation des échantillons, nous avons préparé des étalons et des contrôles de qualité contenant à la fois les analytes et des étalons internes. Nos analystes ont effectué des analyses LC-MS/MS distinctes pour les deux analytes en raison de la différence significative de temps de rétention. Au départ, l’analyse ISR a réussi pour le composé mère, mais a échoué pour le métabolite
Au cours du test ISR, nous avons constaté que la méthode bioanalytique actuelle permettait de mesurer la capécitabine avec précision, mais que les concentrations de 5-FU observées variaient considérablement. C’est pourquoi nous avons lancé une étude visant à déterminer la cause de cette forte variabilité et de la concentration accrue de 5-FU. Il convient de noter que le promédicament n’est pas métabolisé directement en 5-FU, mais passe par un stade intermédiaire, comme indiqué.
Capécitabine → 5’-désoxy-5-fluorocytidine (5’-DFCR) → 5’-désoxy-5-fluorouridine (5’-DFUR) → 5-FU
De plus, des enzymes spécifiques interviennent dans toutes ces transformations
- Carboxylestérase dans le foie (5’-DFCR)
- La cytidine-déaminase dans le foie et le tissu tumoral (5’-DFUR)
- Thymidine phosphorylase (TP) dans le tissu tumoral (5-FU)
Il était donc nécessaire de mesurer d’autres métabolites intermédiaires pour comprendre le problème. Nous avons mené plusieurs expériences afin de déterminer pourquoi la réanalyse des échantillons de 5-FU avait échoué. Cela était principalement dû à la transformation ultérieure d’autres métabolites intermédiaires en 5-FU, ce qui a entraîné des concentrations nettement plus élevées de cette substance lors du test ISR.
Conclusion
Nous avons constaté que la capécitabine et le 5'-DFCR sont instables dans le sang et dans le plasma, tant sur glace qu’à 37 °C. Le 5'-DFUR est instable dans le sang, mais stable dans le plasma. De plus, nous avons observé une augmentation de la concentration de 5'-DFUR dans le plasma, ce qui suggère une conversion à partir de la capécitabine et du 5'-DFCR. Nous en concluons donc que plusieurs mécanismes doivent contribuer à l'augmentation de la concentration de 5-FU dans les échantillons cliniques. In vivo, un biais positif en faveur du 5-FU est donc possible en raison de l’instabilité de la capécitabine et des autres métabolites intermédiaires.
NorthEast Biolab soutient l’ISR tant pour les études précliniques que cliniques. Nos recommandations en matière d’ISR couvrent les études « first-in-human », « first-in-patient », les interactions médicamenteuses, les populations vulnérables, la bioéquivalence/biocomparabilité, la première utilisation d’une méthode et les études pivots. Notre équipe suit des procédures opérationnelles standard (SOP) pour la réalisation, la consignation et l’analyse des résultats ISR. Nous révisons et mettons à jour régulièrement ces SOP afin de répondre aux attentes des autorités réglementaires et de nos clients, et de fournir des données fiables et de haute qualité.
- Viswanathan CT1, Bansal S, Booth B, DeStefano AJ, Rose MJ, Sailstad J, Shah VP, Skelly JP, Swann PG, Weiner R, Validation et mise en œuvre de méthodes bioanalytiques quantitatives : meilleures pratiques pour les dosages chromatographiques et par liaison de ligands, Pharm Res. octobre 2007 ; 24(10) :1962-73. Publication en ligne le 26 avril 2007
- Fast DM, Kelley M, Viswanathan CT, O’Shaughnessy J, King SP, Chaudhary A, Weiner R, DeStefano AJ, Tang D, « Compte rendu et suivi de l’atelier de l’AAPS sur les thèmes d’actualité en bioanalyse BPL : reproductibilité des essais sur des échantillons prélevés – implications des recommandations de Crystal City », AAPS J., juin 2009 ; 11(2) :238-41. doi : 10.1208/s12248-009-9100-9. Publication électronique du 21 avril 2009.
- Chintala, L., Vaka, S., Baranda, J. et al. Oncol Rev (2011) 5 : 129. https://doi.org/10.1007/s12156-011-0074-3
Enregistré et contrôlé par diverses autorités réglementaires
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