Des analyses d'expression génique par PCR en temps réel (également appelées analyses d'expression génique par qRT-PCR ou analyses d'expression génique par qPCR) ont été réalisées sur plusieurs membres de la voie de signalisation Wnt/β-caténine et leurs gènes cibles en aval. Plus précisément, des analyses d’expression génique différentielle, des analyses d’expression par qPCR et des analyses d’expression génique par ddPCR ont été réalisées sur des gènes exprimés de manière différentielle, tels que le membre 16 de la famille Wnt (Wnt16), le facteur de liaison aux promoteurs lymphoïdes (LEF1), le facteur de transcription associé à la mélanogénèse (MITF), la SRY-Box 10 (SOX10), les marqueurs d’adhésion β-caténine-1 (CTNNB1), la cadhérine 1 (CDH1) et la protéase métalloprotéinase matricielle 9 (MMP-9).
Le profil d’expression génique comprenait également plusieurs gènes de base, tels que la sous-unité A de l’ARN polymérase II (POLR2A), l'ARN ribosomique 18S eucaryote (18S), l'actine bêta (ACTB) et la sous-unité P0 de la tige latérale de la protéine ribosomique (RPLP0), qui ont été analysés en tant que gènes de contrôle. Certains de ces gènes différentiellement exprimés présentent des variations du nombre de copies et de faibles niveaux d’expression, ce qui complique une quantification précise. C’est pourquoi une analyse de l’expression génique différentielle, une analyse du nombre de copies ainsi qu’un test de variation du nombre de copies ont été réalisés afin de garantir une quantification précise des niveaux d’expression génique et de prendre en compte d’éventuelles variations du nombre de copies entre les échantillons.
Solution
Un test d’expression génique TaqMan a été utilisé pour optimiser et quantifier les niveaux d’expression de ces gènes à expression différentielle dans des quantités limitées de matrices biologiques humaines prélevées par biopsie. En raison de la quantité limitée d’échantillons et de la grande variation dans l’expression des gènes cibles et des gènes de référence, une optimisation minutieuse et approfondie de l’expression génique par PCR quantitative en temps réel (qPCR) a d’abord été réalisée, avant que l’expression génique ne soit quantifiée sur la plateforme d’expression génique par PCR numérique (ddPCR).
Cette méthode d’optimisation complexe consiste à réaliser des essais d’expression génique par qRT-PCR avec de l’ADN complémentaire (ADNc) dilué en série, afin d’établir une courbe d’étalonnage permettant d’évaluer l’efficacité d’amplification des amorces/sondes – une étape cruciale dans l’analyse de l’expression par qPCR. Dans l’ensemble, la précision de l’analyse de l’expression génique par qPCR est d’une importance cruciale pour garantir la fiabilité de nos résultats dans cette étude portant sur un nombre limité d’échantillons. Cette approche est essentielle pour une analyse précise du nombre de copies et l’étude des variations de ce nombre, en particulier lorsque les quantités d’échantillons sont limitées et que des variations du nombre de copies sont observées au niveau de l’expression génique. Cette méthode est indispensable pour l’analyse des gènes exprimés de manière différentielle et l’établissement de profils d’expression génique, garantissant ainsi des résultats précis et fiables dans l’analyse de l’expression génique différentielle.
Afin de compenser la quantité limitée d’ARN, nous avons utilisé la dPCR (système de PCR numérique QuantStudio Absolute Q) pour l’analyse de l’expression des gènes différentiellement exprimés. Contrairement à l’analyse de l’expression génique par qRT-PCR, qui repose sur la technologie de la PCR en temps réel, l’analyse de l’expression génique par ddPCR consiste à diviser un échantillon en réactions de PCR en temps réel. Certaines réactions contiennent la molécule cible (positives), tandis que d’autres n’en contiennent pas (négatives). Afin d’assurer une transition en douceur de la qPCR à la ddPCR, l’analyse initiale de l’expression génique par qPCR a constitué une base solide pour des mesures précises dans nos expériences.
Une fois l’amplification par PCR terminée, la fraction négative est utilisée pour déterminer, sur une plateforme de PCR numérique à l’aide de la statistique et de l’analyse de Poisson, une quantité absolue correspondant au nombre exact de molécules cibles présentes dans l’échantillon. Cette méthode facilite l’analyse différentielle de l’expression génique et l’analyse du nombre de copies, et offre divers avantages par rapport à l’analyse d’expression par qPCR. Contrairement à la qPCR, l’analyse de l’expression génique par ddPCR ne nécessite pas d’étalons ou de références connus, et les résultats sont présentés sous forme de nombres de copies, ce qui est utile pour établir des profils d’expression génique et réaliser des tests de variation du nombre de copies.
Résultat
Nous avons mis au point une méthode de test d’expression génique TaqMan fiable et transposable pour l’analyse de l’expression génique de gènes cibles dans une matrice biologique limitée, telle qu’une biopsie cutanée. Après optimisation de l’analyse d’expression par qPCR, des tests d’expression génique par PCR en temps réel ont été utilisés pour quantifier le nombre de copies des gènes cibles et des gènes de référence, ce qui permet une analyse précise du nombre de copies. Cette approche facilite l’identification des gènes à expression différentielle et permet l’établissement de profils d’expression génique, ce qui rend possible une analyse exhaustive des variations génétiques et de leurs implications.
Les valeurs d’expression génique (biomarqueurs) s’étant révélées extrêmement précieuses pour le diagnostic et le traitement, l’analyse de l’expression génique par qRT-PCR revêt une importance cruciale. La plateforme d’expression génique ddPCR s’avère être un outil précieux pour la quantification des analytes et la bioanalyse robuste de plusieurs biomarqueurs avec une grande exactitude et une grande précision, tout en ne nécessitant qu’une faible quantité ou un faible volume d’échantillon. Elle est donc idéale pour l’analyse différentielle de l’expression génique, l’analyse du nombre de copies et les tests de variation du nombre de copies dans divers échantillons biologiques.
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