Die in 20/30 Laboren isolierten Pseudomonas aeruginosa-Kolonien wurden zur Reinkultur neu ausplattiert und mittels MALDI-TOF-Bakterienidentifizierung bestätigt. Zur Bestimmung der Verwandtschaftsbeziehung zwischen diesen Kolonien und dem Stamm am Produktionsstandort wurde die Gesamtgenomsequenzierung (WGS) eingesetzt. Es wurden die Extraktion der genomischen DNA (gDNA) und die Vorbereitung der NGS-Bibliothek durchgeführt. Nach der Basenbestimmung wurde eine Multi-Locus-Sequenztypisierung (MLST) für 7 Hausgen-Marker durchgeführt. Diese MLST-Methode wurde auf Wunsch des Kunden angewendet, um die Konsistenz mit dessen bisherigem Vorgehen zu wahren, und 20/30 Labs konnte dies ermöglichen. Zwischen den Isolaten wurde Übereinstimmung festgestellt, wobei das britische Isolat ebenfalls als Pseudomonas aeruginosa ST-17 identifiziert wurde, was einen Ausbruch als Quelle bestätigte. Diese Informationen wurden vom Unternehmen für medizinische Lösungen herangezogen, um zu entscheiden, ob eine gründliche Reinigung und eine Verlegung des Produktionsstandorts erforderlich waren.
20/30 Labs bietet WGS mit sehr kurzen Durchlaufzeiten an, und unsere Berichte enthalten eine detaillierte Erläuterung, was dies für den Kunden bedeutet. Da wir genomische und molekulare Untersuchungen aus der Perspektive eines Mikrobiologen angehen, sind wir bestens aufgestellt, um nicht nur das für WGS erforderliche hochspezialisierte Fachwissen bereitzustellen, sondern auch zu erläutern, was das Ergebnis für Sie und Ihren Kontaminationsfall bedeutet.
— Farzana Sultana, 7 July 2023
Vorgehensweise
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1.
Phase 1: Zielsetzung
Der Kunde stellte eine oder mehrere Wasserproben für die Gesamtgenomsequenzierung (WGS) zur Verfügung.
20/30 Labs sollte die Nanopore GridION-Plattform einsetzen und anschließend eine Multi-Locus-Sequenztypisierung (MLST) am erzeugten Konsensusgenom durchführen, um zu bestätigen, dass es sich bei dem isolierten Organismus um Pseudomonas aeruginosa ST-17 handelt, d. h. um eine Besiedlung aus dem Produktionsstandort.
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2.
Phase 2: Identifizierung und Isolierung von Kolonien
Nach der Membranfiltration und Inkubation zeigten die Proben wie erwartet Wachstum; repräsentative Kolonien wurden entnommen und mittels der Bruker Microflex LT/SH MALDI-TOF-Plattform analysiert. Das MALDI-TOF-System ist die optimale Lösung für eine schnelle und genaue Identifizierung von Bakterien, und 20/30 Labs verfügt über eine umfangreiche, maßgeschneiderte Bibliothek.
Anschließend wurden einzelne charakteristische Kolonien von der Probenplatte isoliert und zu Einzelkolonien in Reinkultur ausgestrichen, die dann zur Extraktion genomischer DNA (gDNA) verwendet wurden.
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3.
Schritt 3: gDNA-Extraktion
Die Extraktion erfolgte unter Verwendung des Qiagen Genomic-Tip-Systems gemäß der Gebrauchsanweisung von Nanopore (Hersteller). Während des gesamten Vorgangs wurde keine Fragmentierung der gDNA vorgenommen.
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4.
Schritt 4: NGS-Bibliotheksaufbereitung und Sequenzierung.
Im Anschluss an die Extraktion erfolgte die NGS-Bibliotheksvorbereitung. Die extrahierte gDNA wurde direkt und ohne vorherige PCR-Amplifikation sequenziert. Dazu wurde die extrahierte gDNA zunächst normalisiert, an den Enden repariert und anschließend für die Ligation der Nanopore-Adaptermoleküle vorbereitet. Anschließend wurden 10 Femtomol der aufbereiteten Bibliothek sofort in eine Nanopore-Flusszelle geladen und die Sequenzierung mit den spezifischen Laufparametern gestartet. Die Sequenzierung führte zur Erzeugung von 15,86 Gb an Lesedaten mit 1,12 Millionen eindeutigen Reads. Nach der De-novo-Genomassemblierung mit dem Flye-Assembler-Tool wurde die mittlere Sequenzierungstiefe auf etwa 1800X bestimmt.
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5.
Schritt 5: Multi-Locus-Sequenztypisierung
Nach der Basenbestimmung wurde für die Probe eine Multi-Locus-Sequenztypisierung (MLST) durchgeführt:
Die vom Kunden bereitgestellten Referenzallele für die sieben MLST-Gene von Pseudomonas aeruginosa (trpE, nuoD, aroE, acsA, guaA, ppsA, mutL) wurden von pubmlst.org heruntergeladen. Anschließend wurde das Tool „krocus“ verwendet, um die Read-Sequenzen der Probe den Referenzallelen zuzuordnen. Der MLST-Typ des Isolats wurde durch den Vergleich der vorhandenen Allele mit der Liste der MLST-Profile für Pseudomonas aeruginosa bestimmt, die von pubmlst.org heruntergeladen wurde. -
6.
Schritt 6: Ergebnis
Es wurde eine Übereinstimmung zwischen den Isolaten festgestellt, wobei das britische Isolat ebenfalls als Pseudomonas aeruginosa ST-17 identifiziert wurde, was einen Ausbruchsherd bestätigte.
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