Die Probenvorbereitung und die Flüssigchromatographie werden bei der Entwicklung und Validierung von LC-MS-Methoden manchmal vernachlässigt, da das Multiple Reaction Monitoring (MRM) bei LC-MS/MS-Analysen eine sehr hohe Selektivität aufweist. Um eine robuste Methode zu erhalten, ist es jedoch notwendig, allen Schritten der Probenreinigung und der Chromatographie Beachtung zu schenken. Darüber hinaus gewährleistet dieser Ansatz die Zuverlässigkeit und minimiert die Notwendigkeit von Anpassungen beim Übergang von einer Studie zur nächsten bis hin zur klinischen Entwicklung.
Bei der Entwicklung und Validierung von LC-MS-Methoden liegen in den frühen Entwicklungsstadien eines Arzneimittels in der Regel nur begrenzte Informationen über dessen Metabolismus vor. Das Arzneimittel und sein Metabolit können im Massenspektrometer ähnlich behandelt werden, wenn es stark metabolisiert wird. Dies erschwert die Sache, da das Massenspektrometer nicht zwischen zwei Substanzen mit derselben Masse und demselben Tochterion unterscheiden kann. Daher ist die Trennung dieser Analyten mittels eines LC-MS/MS-Tests unerlässlich, um Störungen durch Metaboliten zu vermeiden.
Der Einsatz der breiten Palette an Validierungsprotokollen für LC-MS-Methoden gewährleistet die Langlebigkeit der Methode, bewahrt ihre Glaubwürdigkeit und verringert somit die Notwendigkeit, beim Übergang von einer klinischen Studie zur nächsten technische Kompromisse einzugehen, insbesondere während der klinischen Entwicklungsphasen.
Im Gegensatz dazu bieten ELISA-Testmethoden oder Immunoassay-Dienstleistungen, obwohl sie in bestimmten Kontexten wertvoll sind, möglicherweise nicht das gleiche Maß an Spezifität und Selektivität wie LC-MS/MS-Analysen. Immunoassays reagieren sehr empfindlich auf bestimmte Antigene oder Antikörper und erweisen sich als nützlich für die Quantifizierung großer Moleküle wie Proteine oder Peptide. Immunoassay-Dienstleistungen sind jedoch möglicherweise nicht für die Quantifizierung kleiner Moleküle wie Arzneimittel und deren Metaboliten geeignet, insbesondere in komplexen biologischen Matrizen, in denen Kreuzreaktivität und Interferenzen Probleme verursachen. Aus diesem Grund werden vor allem LC-MS/MS-Analysen eingesetzt, da sie präzise und zuverlässige Quantifizierungsdaten liefern, die insbesondere in den frühen Phasen der Arzneimittelentwicklung gefragt sind, wenn noch wenige Informationen über den Metabolismus des Wirkstoffs vorliegen.
Qualität und Konformität
Gemäß den Richtlinien der FDA müssen die Entwicklung und Validierung einer LC-MS-Methode für einen bioanalytischen Test Folgendes umfassen:
- i) die Präzision
- ii) die Richtigkeit
- iii) die Selektivität
- iv) die Spezifität
- v) die Stabilität
Wir verfügen über fundierte praktische Erfahrung in der Entwicklung und Validierung von LC-MS/MS-Methoden, die wir im Rahmen von Hunderten von bioanalytischen Studien – sowohl gemäß den Grundsätzen der Guten Laborpraxis (GLP) als auch darüber hinaus – gesammelt haben. Darüber hinaus ist unsere Bilanz bei Audits durch Aufsichtsbehörden und Inspektoren unserer Kunden nahezu makellos. Bereits seit 2016 haben wir die bei FDA-Audits formulierten Beanstandungen erfolgreich bearbeitet und beantwortet. Schließlich legen wir großen Wert auf wissenschaftliche Exzellenz und hohe Qualität, die wir durch eine sorgfältige Kombination aus selektiver und empfindlicher Chromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS/MS-Test) erreichen.
Aus diesem Grund haben wir die Entwicklung von LC-MS/MS-Methoden zu unserem wichtigsten Instrument für die Durchführung von Bioanalysen gemacht. Darüber hinaus ergänzen wir unser wettbewerbsfähiges Angebot um ELISA-Testmethoden und Immunoassay-Dienstleistungen, was unseren professionellen Status weiter stärkt. Diese ergänzenden Dienstleistungen sind ein wesentlicher Bestandteil unseres Angebots als Auftragsbioanalyselabor, das sich der Bereitstellung maßgeschneiderter Lösungen verschrieben hat. Dank der Synergie zwischen unseren ELISA-Testmethoden, den Immunoanalysedienstleistungen und unserem Fachwissen in der Entwicklung und Validierung von LC-MS-Methoden garantieren wir die umfassende Lösung, die zur Bewältigung der Herausforderungen im Bereich der Grundlagenanalysen erforderlich ist, sodass sich unsere Kunden und die wissenschaftliche Gemeinschaft auf die Qualität der Ergebnisse und unsere Exzellenz verlassen können.
Praxisbeispiel
In diesem Fall bat uns einer unserer Kunden um Unterstützung bei der Entwicklung, Optimierung und Validierung einer LC-MS-Methode. Bei der Analyse der Probe stellten wir fest, dass neben dem Peak des Analyten ein kleiner Peak in Form einer „Schulter“ auftrat. Der betreffende Analyt hatte eine Retentionszeit von 1,5 Minuten. Unser experimenteller Ansatz ermöglichte es, diese Retentionszeit zu verlängern und den Peak des Analyten von den endogenen Substanzen zu trennen, die früher eluierten, da die Probenvorbereitung für die LC-MS auf der Ausfällung von Proteinen basierte. Wir versuchten, dies durch Anpassung der chromatographischen Bedingungen zu erreichen, insbesondere durch die Verwendung einer anderen mobilen Phase und anderer Säulen. Unsere Wissenschaftler bestätigten, dass es sich nicht um einen gespaltenen Peak handelte, der auf eine fehlerhafte Chromatographie oder eine Störung im Kontrollplasma zurückzuführen war, sondern dass er vielmehr auf eine andere Verbindung zurückzuführen war, die denselben MS-Übergang aufwies. Wir stellten daher die Hypothese auf und begannen zu untersuchen, ob dieses Problem auf einen Metaboliten mit einem ähnlichen Übergang zurückzuführen war.
Im Rahmen dieser Studie haben wir zudem die Möglichkeit geprüft, zusätzlich zum LC-MS/MS-Test eine ELISA-Testmethode oder Immunoassay-Dienstleistungen einzusetzen. Diese Methoden könnten eine höhere Spezifität und Empfindlichkeit bieten, insbesondere beim Nachweis und der Quantifizierung des Zielanalyten und potenziell störender Verbindungen. Wir haben jedoch zunächst der Optimierung der LC-MS-Methodenentwicklung Vorrang eingeräumt, um die beobachteten Peak-Interferenzen zu beheben, da diese Methode die direkte Quantifizierung und Identifizierung des Analyten und potenzieller Metaboliten ermöglichte. Dennoch könnte im Rahmen zukünftiger Studien der Einsatz ergänzender Techniken, wie beispielsweise der ELISA-Methode oder immunoanalytischer Verfahren, in Betracht gezogen werden, um die analytische Robustheit und die Genauigkeit der Analyse zu verbessern.
Die Validierung der LC-MS-Methode und die Probenvorbereitung für die LC-MS sind wesentliche Bestandteile unseres Ansatzes, um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit unserer Analysemethoden zu gewährleisten.
Bei der Trennung der beiden Peaks im Rahmen der Validierung der LC-MS-Methode stellten wir fest, dass die Intensität des Störpeaks von Probe zu Probe variierte. Es zeigte sich, dass dieses Rauschen von einem Metaboliten herrührte. Außerdem gingen wir davon aus, dass es sich bei diesem Metaboliten um ein Glucuronid-Konjugat handelte, da der betreffende Peak früher eluierte als die Analyten. Zu diesem Zeitpunkt stand uns jedoch kein Referenzstandard für das Glucuronid zur Verfügung. Schließlich konnten wir nach der enzymatischen Hydrolyse der Plasmaproben bestätigen, dass dieser Peak tatsächlich einem Glucuronid-Konjugat entsprach. Damit haben wir die Methode erfolgreich validiert und auf die Analyse von Plasmaproben angewendet.
Obwohl wir uns auf die Entwicklung, Optimierung und Validierung von LC-MS-Methoden konzentriert haben, bieten wir auch Dienstleistungen im Bereich der Entwicklung von ELISA- und Immunoassay-Testmethoden an, um den vielfältigen Anforderungen unserer Kunden im Bereich der bioanalytischen Forschung gerecht zu werden.
Schlussfolgerung
Das Glucuronid-Konjugat des Analyten war in den klinischen Proben vorhanden, und die chromatographische Trennung erwies sich als unerlässlich, um diese Störung zu vermeiden.
Die Entwicklung und Validierung von LC-MS/MS-Methoden sind hervorragende Werkzeuge zur Gewährleistung der Selektivität, doch dürfen wir bei der Probenreinigung und der chromatographischen Trennung keine Abstriche machen. Es muss eine ausreichende Retentionszeit vorgesehen werden, um früh eluierende endogene Verbindungen und Metaboliten des Analyten voneinander zu trennen.
NorthEast Biolab bietet ein umfassendes Spektrum an bioanalytischen Dienstleistungen an, darunter:
- Entwicklung, Validierung und Analyse klinischer LC-MS/MS-Methoden
- Nichtklinische bioanalytische Unterstützung für LC-MS/MS, einschließlich Dosierungsbereichsstudien (DRF)
- Entwicklung, Validierung und Analyse von toxikologischen Methoden gemäß den GLP-Richtlinien
Neben der Entwicklung und Validierung von LC-MS/MS-Methoden bieten wir auch die Entwicklung von ELISA-Testmethoden sowie Dienstleistungen im Bereich der Immunoassays an. Unser Team befolgt Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für die Entwicklung, Optimierung und Validierung bioanalytischer Methoden. Wir überprüfen und aktualisieren diese SOPs regelmäßig, um die gesetzlichen Vorschriften und die Erwartungen unserer Kunden zu erfüllen und zuverlässige, qualitativ hochwertige Daten zu liefern.
Bei der Entwicklung von LC-MS-Methoden legen wir besonderen Wert auf eine robuste chromatographische Trennung, um Störungen wie beispielsweise an Glutacuronid konjugierte Metaboliten zu vermeiden. Unsere Verfahren zur Entwicklung und Validierung von LC-MS-Methoden gewährleisten eine präzise und zuverlässige Quantifizierung der Analyten in komplexen Matrizen. Darüber hinaus sind wir auf Probenvorbereitungstechniken für die LC-MS spezialisiert, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und Matrixeffekte zu minimieren, was letztendlich zur Optimierung der Methodenleistung und der Datenqualität beiträgt.
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