Die Methodenvalidierung in pharmakokinetischen und bioanalytischen Studien gewährleistet qualitativ hochwertige Ergebnisse, indem Verzerrungen und Fehler auf ein Minimum reduziert werden. Der Validierungsprozess umfasst die Bewertung der Selektivität, Spezifität, Sensitivität, Genauigkeit, Präzision, Wiederfindbarkeit und Stabilität des Analyten. Wir führen diese Validierungen an Qualitätskontrollproben (QC-Proben) durch, die durch Anreicherung einer arzneimittelfreien Matrix – stammend von menschlichen Probanden oder Tieren – mit einer Referenzverbindung hergestellt werden, deren Identität und Konzentration bekannt sind.
Aus verschiedenen Gründen spiegeln die Qualitätskontrollproben jedoch nicht immer die Aktivität der getesteten Verbindung in den untersuchten Proben wider. Beispiele hierfür sind eine unzureichende Wiederfindung der Verbindung, Heterogenität der Probe, das Vorhandensein von Metaboliten, Proteinbindung und Matrixunterdrückungseffekte usw. In diesem Zusammenhang kommt der erneuten Analyse der Originalproben (ISR) entscheidende Bedeutung zu. Ein ISR-Test besteht darin, die Originalproben erneut zu analysieren, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse der Erstanalyse sicherzustellen.
Regelungen
Die ersten Diskussionen über die Notwendigkeit von Leitlinien zur erneuten Analyse bereits untersuchter Proben – ausgelöst durch die große Variabilität der erneut analysierten Proben im Vergleich zu den ursprünglichen Ergebnissen in bestimmten Studien, wie von der FDA beobachtet – fanden im Mai 2006 im Rahmen des AAPS/FDA-Bioanalytik-Workshops mit dem Titel „Validierung und Umsetzung quantitativer bioanalytischer Methoden: Best Practices für chromatographische und Ligandenbindungsassays“ statt. Anschließend trafen sich im Februar 2008 führende Vertreter der Industrie, um im Rahmen des AAPS/FDA-Bioanalytik-Workshops mit dem Titel „AAPS-Workshop zu aktuellen Themen der GLP-Bioanalytik: Reproduzierbarkeit von Versuchen an veränderten Proben – Auswirkungen der Empfehlungen von Crystal City“ zusammen, um allgemeine Verfahren zur erneuten Analyse veränderter Proben zu erörtern, und veröffentlichte im Juni 2009 Erwartungen hinsichtlich der Durchführung, Dokumentation und Kommunikation der Ergebnisse von ISR-Versuchen. Die Europäische Arzneimittelagentur (EMA) war die erste, die regulatorische Leitlinien zur ISR-Analyse veröffentlichte. Die FDA folgte 2013 mit der Veröffentlichung ihres eigenen Entwurfs.
Das ISR-Mandat der FDA
- Verlangt die erneute Analyse der gewonnenen Proben (ISR) für alle entscheidenden in-vivo-PK/PD- und BE-Studien am Menschen; die ISR muss mindestens einmal pro Methode und pro Tierart im Rahmen nichtklinischer Sicherheitsstudien durchgeführt werden
- Die ISR-Analyse bereits in der Pilotphase der Methodenentwicklung und -validierung integrieren, um die Umsetzung von Korrekturmaßnahmen vor der entscheidenden Studie zu ermöglichen; die erneute Analyse bestehender Proben in größerer Anzahl und mit größerer Variabilität für entscheidende PK/PD-Studien überprüfen
- Maximal 10 % der Studienproben für den ISR-Test auswählen
- Die Proben so auswählen, dass das gesamte PK/PD-Profil aller Probanden angemessen abgedeckt wird, einschließlich der Messungen zu Zeitpunkten nahe der Cmax und am Ende der Eliminationsphase
- Die Analyse ist unter Verwendung der ursprünglichen bioanalytischen Methode (einschließlich der Anzahl der Wiederholungen und gegebenenfalls angewandter Verdünnungsfaktoren) durchzuführen, und die erneut analysierten Proben sind mit frisch hergestellten Kalibrierungsproben zu vergleichen
- Mindestens zwei Drittel (67 %) der Ergebnisse der ISR-Tests müssen bei kleinen Molekülen innerhalb von 20 % und bei großen Molekülen innerhalb von 30 % der ursprünglichen Ergebnisse liegen; Die prozentuale Abweichung wird wie folgt berechnet: (Wiederholung – ursprüngliches Ergebnis) * 100 / Mittelwert
- Es besteht keine gesetzliche Verpflichtung, zusätzliche Analysen durchzuführen, wenn eine einzelne Probe die oben genannten Akzeptanzkriterien nicht erfüllt; bei einer signifikanten Abweichung wird ein wissenschaftliches Gutachten erwartet
- Unterbrechen Sie die Analysen, leiten Sie eine Untersuchung ein und dokumentieren Sie diese, wenn die erneute Analyse der verwendeten Proben insgesamt die Akzeptanzkriterien nicht erfüllt
- Dokumentieren Sie alle Auswertungen der ISR-Tests, um den Verlauf der Studie und eventueller Folgestudien nachvollziehen zu können
Studie
Wir haben eine ISR-Analyse zu Capecitabin durchgeführt, einem Chemotherapeutikum, das zur Behandlung zahlreicher Krebsarten wie Brust-, Dickdarm-, Enddarm-, Magen-, Speiseröhren- und Bauchspeicheldrüsenkrebs eingesetzt wird. Dieses Medikament ist ein rational entwickeltes Prodrug von 5-Fluorouracil (FU), das die kontinuierliche Infusion von 5-FU nachahmt und gleichzeitig die mit der intravenösen Verabreichung verbundenen Komplikationen und Nachteile vermeidet. Dieser Antimetabolit wird in unveränderter Form über den Magen-Darm-Trakt resorbiert, enzymatisch in das aktive 5-FU umgewandelt und direkt im Tumor freigesetzt. Daher ist eine genaue Bestimmung von 5-FU durch Nachanalyse der verwendeten Proben ein wesentlicher Bestandteil dieser Studie.
Wir haben sowohl Capecitabin als auch dessen Metaboliten 5-FU gemessen. Zur Probenvorbereitung haben wir Standardlösungen und Qualitätskontrollen hergestellt, die sowohl die Analyten als auch interne Standards enthielten. Unsere Analytiker führten aufgrund der signifikanten Unterschiede in den Retentionszeiten separate LC-MS/MS-Analysen für die beiden Analyten durch. Zunächst war die ISR-Analyse für die Mutterverbindung erfolgreich, schlug jedoch für den Metaboliten fehl
Im Verlauf des ISR-Tests stellten wir fest, dass die derzeitige bioanalytische Methode zwar eine genaue Messung von Capecitabin ermöglichte, die beobachteten 5-FU-Konzentrationen jedoch stark variierten. Aus diesem Grund haben wir eine Studie initiiert, um die Ursache für diese hohe Variabilität und die erhöhte 5-FU-Konzentration zu ermitteln. Es ist zu beachten, dass das Prodrug nicht direkt zu 5-FU metabolisiert wird, sondern, wie dargestellt, ein Zwischenstadium durchläuft.
Capecitabin → 5’-Desoxy-5-fluorocytidin (5’-DFCR) → 5’-Desoxy-5-fluorouridin (5’-DFUR) → 5-FU
Zudem sind an all diesen Umwandlungen spezifische Enzyme beteiligt
- Carboxylesterase in der Leber (5’-DFCR)
- Cytidin-Deaminase in der Leber und im Tumorgewebe (5’-DFUR)
- Thymidinphosphorylase (TP) im Tumorgewebe (5-FU)
Es war daher notwendig, weitere Zwischenmetaboliten zu messen, um das Problem zu verstehen. Wir haben mehrere Experimente durchgeführt, um festzustellen, warum die erneute Analyse der 5-FU-Proben fehlgeschlagen war. Dies war hauptsächlich auf die anschließende Umwandlung weiterer Zwischenmetaboliten in 5-FU zurückzuführen, was zu deutlich höheren Konzentrationen dieser Substanz beim ISR-Test führte.
Schlussfolgerung
Wir haben festgestellt, dass Capecitabin und 5'-DFCR sowohl im Blut als auch im Plasma instabil sind, sowohl auf Eis als auch bei 37 °C. 5'-DFUR ist im Blut instabil, im Plasma jedoch stabil. Zudem beobachteten wir einen Anstieg der 5'-DFUR-Konzentration im Plasma, was auf eine Umwandlung aus Capecitabin und 5'-DFCR hindeutet. Wir schließen daraus, dass mehrere Mechanismen zum Anstieg der 5-FU-Konzentration in den klinischen Proben beitragen müssen. In vivo ist daher aufgrund der Instabilität von Capecitabin und den anderen Zwischenmetaboliten eine positive Verzerrung zugunsten von 5-FU möglich.
NorthEast Biolab unterstützt die klinische Forschung sowohl bei präklinischen als auch bei klinischen Studien. Unsere Empfehlungen im Bereich ISR umfassen „First-in-Human“- und „First-in-Patient“-Studien, Arzneimittelwechselwirkungen, gefährdete Bevölkerungsgruppen, Bioäquivalenz/Biovergleichbarkeit, die erstmalige Anwendung einer Methode sowie Pivotalstudien. Unser Team befolgt Standardarbeitsanweisungen (SOPs) für die Durchführung, Dokumentation und Auswertung der ISR-Ergebnisse. Wir überprüfen und aktualisieren diese SOPs regelmäßig, um den Erwartungen der Zulassungsbehörden und unserer Kunden gerecht zu werden und zuverlässige, qualitativ hochwertige Daten zu liefern.
- Viswanathan CT1, Bansal S, Booth B, DeStefano AJ, Rose MJ, Sailstad J, Shah VP, Skelly JP, Swann PG, Weiner R, Validierung und Umsetzung quantitativer bioanalytischer Methoden: Best Practices für chromatographische und Ligandenbindungs-Assays, Pharm Res. Oktober 2007; 24(10):1962–73. Online veröffentlicht am 26. April 2007
- Fast DM, Kelley M, Viswanathan CT, O’Shaughnessy J, King SP, Chaudhary A, Weiner R, DeStefano AJ, Tang D, „Bericht und Nachbereitung des AAPS-Workshops zu aktuellen Themen der GLP-Bioanalytik: Reproduzierbarkeit von Versuchen an entnommenen Proben – Auswirkungen der Empfehlungen von Crystal City“, AAPS J., Juni 2009; 11(2):238–41. doi: 10.1208/s12248-009-9100-9. Online veröffentlicht am 21. April 2009.
- Chintala, L., Vaka, S., Baranda, J. et al. Oncol Rev (2011) 5: 129. https://doi.org/10.1007/s12156-011-0074-3
Zugelassen und geprüft durch verschiedene Aufsichtsbehörden
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