Es wurden Echtzeit-PCR-Genexpressionsanalysen (auch als qRT-PCR-Genexpressionsanalysen oder qPCR-Genexpressionsanalysen bezeichnet) an mehreren Mitgliedern des Wnt/β-Catenin-Signalwegs und deren nachgeschalteten Zielgenen durchgeführt. Genauer gesagt wurden differentielle Genexpressionsanalysen, qPCR-Expressionsanalysen und ddPCR-Genexpressionsanalysen an differentiell exprimierten Genen wie Wnt Family Member 16 (Wnt16), Lymphoid Enhancer-Binding Factor (LEF1), Melanogenesis Associated Transcription Factor (MITF), SRY-Box 10 (SOX10), die Adhäsionsmarker β-Catenin-1 (CTNNB1), Cadherin 1 (CDH1) und die Protease Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9).
Die Genexpressionsprofilierung umfasste zudem mehrere Housekeeping-Gene, wie die RNA-Polymerase-II-Untereinheit A (POLR2A), eukaryotische 18S-rRNA (18S), Aktin-beta (ACTB) und die ribosomale Protein-Lateral-Stalk-Untereinheit P0 (RPLP0), die als Kontrollgene analysiert wurden. Einige dieser differentiell exprimierten Gene weisen Kopienzahlvariationen und niedrige Expressionsniveaus auf, was eine genaue Quantifizierung erschwert. Daher wurden eine Analyse der differentiellen Genexpression, eine Kopienzahlanalyse sowie ein Test auf Kopienzahlvariation durchgeführt, um eine genaue Quantifizierung der Genexpressionsniveaus zu gewährleisten und mögliche Kopienzahlvariationen zwischen den Proben zu berücksichtigen.
Lösung
Es wurde ein TaqMan-Genexpressionstest verwendet, um die Expressionsniveaus dieser differentiell exprimierten Gene in begrenzten Mengen menschlicher biologischer Matrizen, die mittels Biopsie gewonnen wurden, zu optimieren und zu quantifizieren. Aufgrund der begrenzten Probenmenge und der großen Variation in der Expression der Ziel- und Housekeeping-Gene wurde zunächst eine sorgfältige und gründliche Optimierung der quantitativen Echtzeit-PCR-Genexpression (qPCR) durchgeführt, bevor die Genexpression auf der Digital-PCR (ddPCR)-Genexpressionsplattform quantifiziert wurde.
Diese komplexe Optimierungsmethode umfasst die Durchführung von qRT-PCR-Genexpressionsversuchen mit seriell verdünnter komplementärer DNA (cDNA), um eine Standardkurve zur Bewertung der Amplifikationseffizienz von Primern/Sonden zu erstellen – ein entscheidender Schritt in der qPCR-Expressionsanalyse. Insgesamt ist die Präzision bei der qPCR-Analyse der Genexpression von entscheidender Bedeutung, um die Zuverlässigkeit unserer Ergebnisse in dieser Studie mit einer begrenzten Anzahl von Proben zu gewährleisten. Dieser Ansatz ist entscheidend für eine genaue Analyse der Kopienzahl und die Untersuchung von Schwankungen der Kopienzahl, insbesondere bei begrenzten Probenmengen und Schwankungen der Kopienzahl auf der Ebene der Genexpression. Dieses Verfahren ist unerlässlich für die Analyse differentiell exprimierter Gene und die Erstellung von Genexpressionsprofilen, wodurch genaue und zuverlässige Ergebnisse bei der differentiellen Genexpressionsanalyse gewährleistet werden.
Um die begrenzte RNA-Menge auszugleichen, haben wir dPCR (QuantStudio Absolute Q Digital PCR System) für die Genexpressionsanalyse differentiell exprimierter Gene verwendet. Im Gegensatz zur qRT-PCR-Genexpressionsanalyse, die auf der Echtzeit-PCR-Technologie basiert, umfasst die ddPCR-Genexpressionsanalyse die Aufteilung einer Probe in Echtzeit-PCR-Reaktionen. Einige Reaktionen enthalten das Zielmolekül (positiv), andere hingegen nicht (negativ). Um einen nahtlosen Übergang von der qPCR zur ddPCR zu gewährleisten, bildete die anfängliche qPCR-Genexpressionsanalyse eine solide Grundlage für präzise Messungen in unseren Experimenten.
Nach Abschluss der PCR-Amplifikation wird die negative Fraktion verwendet, um auf einer digitalen PCR-Plattform mithilfe der Poisson-Statistik und -Analyse eine absolute Menge für die genaue Anzahl der Zielmoleküle in der Probe zu ermitteln. Diese Methode erleichtert die differentielle Genexpressionsanalyse und die Kopienzahlanalyse und bietet gegenüber der qPCR-Expressionsanalyse verschiedene Vorteile. Im Gegensatz zur qPCR erfordert die ddPCR-Genexpression keine bekannten Standards oder Referenzen, und die Ergebnisse werden als Kopienzahlen dargestellt, was bei der Erstellung von Genexpressionsprofilen und der Durchführung von Assays zur Kopienzahlvariation hilfreich ist.
Ergebnis
Wir haben eine zuverlässige und übertragbare TaqMan-Genexpressions-Testmethode für die Genexpressionsanalyse von Zielgenen in einer begrenzten biologischen Matrix, wie beispielsweise einer Hautbiopsie, entwickelt. Nach der Optimierung der qPCR-Expressionsanalyse wurden Echtzeit-PCR-Genexpressionstests eingesetzt, um die Kopienzahl von Zielgenen und Housekeeping-Genen zu quantifizieren, was eine genaue Analyse der Kopienzahl ermöglicht. Dieser Ansatz erleichtert die Identifizierung differentiell exprimierter Gene und ermöglicht die Erstellung von Genexpressionsprofilen, wodurch eine umfassende Analyse genetischer Variationen und deren Auswirkungen möglich wird.
Da sich Genexpressionswerte (Biomarker) als äußerst wertvoll für Diagnose und Therapie erwiesen haben, ist die qRT-PCR-Genexpressionsanalyse von entscheidender Bedeutung. Die ddPCR-Genexpressionsplattform erweist sich als wertvolles Werkzeug für die Quantifizierung von Analyten und die robuste Bioanalyse mehrerer Biomarker mit hoher Genauigkeit und Präzision, wobei nur eine geringe Menge oder ein geringes Probenvolumen erforderlich ist. Dies macht sie ideal für die differentielle Genexpressionsanalyse, die Kopienzahlanalyse und Tests zur Kopienzahlvariation in verschiedenen biologischen Proben.
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