Die Konzentration der Aminosäuren Prolin und Hydroxyprolin in biologischen Proben wie Blut, Urin oder Gewebe, kann Aufschluss über den Zustand des Kollagenstoffwechsels und dessen Erneuerung geben und als Indikator für physiologische und pathologische Zustände wie Alterung, Entzündungen und Krebs dienen. Die Analyse von Prolin und Hydroxyprolin in Mausgewebe birgt jedoch mehrere analytische Herausforderungen, wie beispielsweise die geringe Konzentration dieser Aminosäuren in der Gewebematrix, die hohe Polarität dieser Aminosäuren, wodurch sie sich mittels herkömmlicher Umkehrphasenchromatographie nur schwer zurückhalten und trennen lassen, die Interferenz durch andere Aminosäuren sowie durch peptidgebundene Formen von Prolin und Hydroxyprolin, die die Genauigkeit und Spezifität der Messung beeinträchtigen können,
sowie das Vorhandensein variierender endogener Konzentrationen von Prolin und Hydroxyprolin in verschiedenen Geweben wie Leber, Nieren, Lunge und Herz, was eine genaue Quantifizierung zusätzlich erschwert. Daher ist eine empfindliche, selektive und zuverlässige Methode zur Quantifizierung von Prolin und Hydroxyprolin in Mausgeweben erforderlich, was dazu beitragen könnte, die Rolle und Regulation dieser Aminosäuren bei der Synthese und dem Abbau von Kollagen sowie ihre Beteiligung an verschiedenen pathologischen Prozessen aufzuklären. In dieser Hinsicht bietet die hydrophile Interaktions-Flüssigkeitschromatographie (HILIC) aufgrund ihrer
Lösung
Um diese Herausforderungen zu bewältigen, haben wir eine Methode auf Basis der Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC–MS/MS) zur Quantifizierung von Prolin und Hydroxyprolin in Mausgeweben entwickelt und validiert. Die Methode umfasste folgende Schritte:
- Homogenisierung des Gewebes und dessen Säurehydrolyse, wodurch freie Aminosäuren aus der Gewebematrix sowie an Peptide gebundene Formen von Prolin und Hydroxyprolin freigesetzt wurden
- Eine Zeitverlaufsstudie zur Bestimmung der optimalen Hydrolysezeit für jeden Gewebetyp im Hinblick auf die maximale Ausbeute an Prolin- und Hydroxyprolin-haltigen Aminosäuren
- Ausfällung der Proteine mit Acetonitril, wodurch Proteine und andere störende Substanzen aus dem Hydrolysat entfernt werden
- Verdünnung des Überstands mit Wasser, wodurch die Zusammensetzung des Lösungsmittels und die Konzentration der Analyten im Hinblick auf deren Injektion in das LC–MS/MS-System angepasst werden konnten;
- Chromatographische Trennung auf einer HILIC-Säule (Hydrophile Interaction Liquid Chromatographie), bei der die polaren Aminosäuren zurückgehalten und durch eine Gradientenelution mit Acetonitril und Wasser, das 0,1 % Ameisensäure enthielt, getrennt wurden
- Nachweis und Quantifizierung der Aminosäure Prolin und von Hydroxyprolin mithilfe eines Massenspektrometers, das im Modus der positiven Elektrospray-Ionisation und im Modus der Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) betrieben wurde, wodurch die für jeden Analyten spezifischen Vorläufer- und Produktionen ausgewählt und gemessen werden konnten
- Verwendung einer Aminosäuremischung als interner Standard, wodurch der Matrixeffekt sowie die mit der Probenvorbereitung und der Analyse verbundenen Schwankungen kompensiert werden konnten, wodurch ein einziger interner Standard gewonnen werden konnte, der die Konzentrationsschwankungen beider Analyten originalgetreu widerspiegelt und eine lineare Reaktion in Abhängigkeit von der Prolin- und Hydroxyprolinkonzentration aufweist.
Unser ganzheitlicher Ansatz gewährleistet somit eine präzise und zuverlässige Quantifizierung von Prolin und ermöglicht es, die Schwierigkeiten bei der Analyse dieser Aminosäuren in Mausgeweben zu überwinden. Die Hypothese lautet, dass Störungen der Kollagensynthese, die häufig durch Veränderungen im Prolin- und Hydroxyprolin-Stoffwechsel gekennzeichnet sind, mit schwerwiegenden Erkrankungen in Verbindung stehen, insbesondere mit Fibrose und Bindegewebserkrankungen. Dank der Präzision unserer Methode zur Messung dieser Aminosäuren können Forscher ihr Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Kollagen-assoziierten Erkrankungen vertiefen und potenzielle therapeutische Interventionen untersuchen, die darauf abzielen, die Kollagensynthesewege zu beeinflussen, um menschliches Leid zu lindern.
Ergebnisse
Die Methode wurde gemäß den Richtlinien der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) für bioanalytische Methoden validiert und wies bei der Messung von Prolin und Hydroxyprolin in Mausgewebe – wesentliche Bestandteile der Kollagensynthese – eine gute Genauigkeit, Präzision, Linearität, Präzision, Selektivität, Wiederfindungsrate, Matrixeffekt und Stabilität bei der Messung von Prolin und Hydroxyprolin in Mausgewebe, die wesentliche Bestandteile der Kollagensynthese sind. Die Methode nutzte die hydrophile Interaktions-Flüssigkeitschromatographie (HILIC) als robuste Trenntechnik. Dieser chromatographische Ansatz ermöglichte eine hervorragende Auflösung und eine optimale Peakform für Prolin und Hydroxyprolin, was eine präzise Quantifizierung ermöglichte.
Diese Technik wurde eingesetzt, um die Schwankungen der Konzentrationen der freien Aminosäuren Prolin und Hydroxyprolin in verschiedenen Lungengeweben von Mäusen zu untersuchen – darunter normales, entzündliches, fibrotisches und tumoröses Gewebe – untersucht, wobei die hydrophile Interaktionsflüssigkeitschromatographie eingesetzt wurde, um eine gute Trennung der Verbindungen zu gewährleisten. Diese chromatographische Technik war unser wichtigstes Werkzeug zum Nachweis der Aminosäuren Prolin und Hydroxyprolin in mikromolaren Konzentrationen. Die Empfindlichkeit und Eignung der HILIC für die Analyse dieser Analyten in komplexen Biomatrizen wurde ebenfalls nachgewiesen.
Die Methode zeigte signifikante Unterschiede in der Konzentration und im Verhältnis von Prolin zu Hydroxyprolin zwischen verschiedenen Gewebetypen, was auf Veränderungen im Stoffwechsel und im Kollagenumsatz bei verschiedenen klinischen Bildern hindeutet. Die Prolin-Bestimmungsmethode könnte zur Erforschung der Rolle und Regulation der Aminosäuren Prolin und Hydroxyprolin in Mausmodellen verschiedener Erkrankungen beitragen, wie beispielsweise Entzündungen, Fibrose und Krebs sowie zur Bewertung der Wirkung therapeutischer Maßnahmen auf die Kollagensynthese und den Kollagenabbau. Die Methode zur Bestimmung von Prolin könnte auch auf andere Gewebearten wie Leber, die Nieren und das Herz sowie auf andere biologische Proben wie Blut und Urin ausgeweitet werden, um die Prolin- und Hydroxyprolin-Exposition sowie die damit verbundenen Risiken in Mäusepopulationen zu bewerten.
Zugelassen und kontrolliert durch verschiedene Aufsichtsbehörden
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