Chemopräventive Wirkstoffe, die darauf abzielen, die Auswirkungen genotoxischer Verbindungen zu verringern, sind von besonderem Interesse. Wenn diese Verbindungen mit der DNA reagieren, bilden sie kovalente Modifikationen, auch DNA-Addukte genannt, die die Struktur und Funktion der DNA verändern können. Um die Rolle von DNA-Addukten bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krankheiten zu verstehen, ist es wichtig, sie in biologischen Proben wie Blut, Urin oder Gewebe zu messen. Dies ist das Ziel der DNA-Adduktomik, eines neuen Forschungsgebiets, das sich der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) bedient, um auf umfassende und unvoreingenommene Weise nach bekannten und unbekannten DNA-Addukten zu suchen.
Die DNA-Adduktomik stellt jedoch eine Herausforderung dar, insbesondere bei der Anwendung auf zellbasierte In-vitro-Proben, die häufig verwendet werden, um die Auswirkungen genotoxischer Verbindungen auf verschiedene Zelltypen zu untersuchen. Zu den Herausforderungen zählen unter anderem die geringe Menge und Qualität der aus kultivierten Zellen verfügbaren DNA, die Interferenz durch Bestandteile der Zellkultur wie Serumproteine und Zusätze zum Kulturmedium sowie der Bedarf an Referenzstandards und Spektralbibliotheken für die Analyse von DNA-Addukten.
Lösung
Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine LC–MS/MS-Methode entwickelt, validiert und angewendet, um DNA-Addukte in zellbasierten In-vitro-Proben zu analysieren. Die Methode umfasste die folgenden Schritte:
- Isolierung der DNA aus kultivierten Zellen mithilfe eines handelsüblichen Kits, was eine hohe Ausbeute und Reinheit der DNA garantierte
- Enzymatische Hydrolyse der DNA zu Nukleosiden, wodurch die Komplexität der Probe verringert und die Empfindlichkeit der Analyse erhöht wurde
- Online-Festphasenextraktion und Trennung der Nukleoside mittels Umkehrphasenchromatographie, wodurch die Interferenz durch Zellkulturkomponenten beseitigt und eine gute Auflösung der Analyten erreicht wurde
- Nachweis und Identifizierung von DNA-Addukten mit einem hochauflösenden Massenspektrometer, das im Modus der positiven Elektrospray-Ionisation (ESI+) und im Modus der datenunabhängigen Erfassung (DIA), wodurch die gleichzeitige Erfassung von Vorläufer- und Fragmentionsspektren für alle Analyten ermöglicht wurde
Die Methode wurde nach dem „Fit-for-Purpose“-Ansatz qualifiziert, wobei die Leistungsfähigkeit der Methode auf der Grundlage des beabsichtigten Verwendungszwecks und vordefinierter Akzeptanzkriterien bewertet wurde. Die Methode zeigte beim Nachweis und der Quantifizierung von DNA-Addukten in zellbasierten In-vitro-Proben hinsichtlich Genauigkeit, Präzision, Linearität, Selektivität und Stabilität akzeptable Leistungsmerkmale.
Die Methode wurde zur Analyse von DNA-Addukten angewendet, die durch verschiedene genotoxische Verbindungen, darunter Benzo[a]pyren, Aflatoxin B1 und Acetaldehyd, in verschiedenen Zelllinien wie HepG2, A549 und TK6, die verschiedene Organe und Gewebe repräsentieren.
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Ergebnis
Die Methode bot ein sensibles und zuverlässiges Instrument zur Analyse von DNA-Addukten in zellbasierten In-vitro-Proben und ermöglichte es, die Reparatur von DNA-Addukten sowie deren Bildung in verschiedenen Zellmodellen zu untersuchen. Die Methode trug zudem zum Fortschritt der DNA-Adduktomik bei, indem sie neue Daten und Erkenntnisse über das Vorkommen und die Vielfalt von DNA-Addukten in biologischen Systemen lieferte.
Die Methode könnte für die Untersuchung der Mechanismen und Folgen von DNA-Schäden durch genotoxische Verbindungen sowie für die Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit chemopräventiver Mittel wie Antioxidantien, Polyphenole und sekundäre Pflanzenstoffe, die die Bildung und Reparatur von DNA-Addukten beeinflussen können. Die Methode könnte auch auf andere biologische Proben, wie menschliche Gewebe oder Körperflüssigkeiten, angewendet werden, um die Exposition gegenüber und das Risiko von DNA-Schäden in menschlichen Populationen zu bewerten. Dieser umfassende Ansatz vereint die Analyse von DNA-Addukten, die Erforschung der DNA-Adduktomik und die Bewertung chemopräventiver Wirkstoffe und liefert wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die DNA-Schäden zugrunde liegen, sowie in mögliche Strategien zur Prävention und Intervention.
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