Wir haben die Entwicklung einer Oligonukleotid-Analysemethode und die GLP-Validierung abgeschlossen, um das Aptamer des Auftraggebers in Ratten-, Kaninchen- und Humanplasma sowie in menschlichem Urin mittels Oligonukleotid-Hybridisierungsanalyse zu quantifizieren.
Diese Oligonukleotid-Analyse umfasste einen Sandwich-Hybridisierungs-ELISA mit einem komplementären Oligonukleotid zum Einfangen und einem mit Biotin-markiertes komplementäres Oligonukleotid zum Nachweis, gefolgt von der Zugabe von Streptavidin SULFO-TAG und dem Nachweis der elektrochemilumineszenten (ECL) Reaktion auf der Meso Scale Discovery (MSD)-Plattform zur Quantifizierung von Oligonukleotiden.
Lösung
Einer unserer Auftraggeber benötigte einen reproduzierbaren PK-Oligonukleotid-Test mit hoher Sensitivität für sein Oligonukleotid-Arzneimittel. Zu diesem Zweck haben wir einen auf Meso Scale Discovery basierenden Test in Kombination mit einer Oligonukleotid-Hybridisierungsanalyse durchgeführt.
Unser erfahrenes Team hat jeden Schritt dieser ECL-Methode zur Oligonukleotid-Hybridisierung optimiert, um die Leistung und Robustheit des Oligonukleotid-Tests zu verbessern.
Zunächst nutzte unser Team einen „Checkerboard“-Ansatz, um die optimalen Konzentrationen für die Beschichtungs- und Detektions-Oligonukleotide, die Blockierungsbedingungen, die Temperatur für die Oligonukleotid-Denaturierung, -Anlagerung und -Hybridisierung sowie die Inkubationsdauer zu bestimmen. Wir haben außerdem die richtige Probenverdünnung ermittelt, da dieser Analyt bei höheren Konzentrationen einen „Hook-Effekt“ zeigte.
Die MSD-Multi-Array-Oligonukleotid-Analyseplatte wurde über Nacht mit dem Capture-Oligonukleotid beschichtet. Standards und Proben wurden aufbereitet, durch Erhitzen inaktiviert und mit dem biotinmarkierten Detektions-Oligonukleotid kombiniert. Anschließend wurde diese Mischung in einem Thermocycler annealed und in der beschichteten Platte inkubiert, um die Oligonukleotid-Hybridisierungsanalyse zu ermöglichen. Anschließend haben wir die ungebundenen Oligonukleotide weggewaschen und das ECL-Signal des hybridisierten Oligonukleotids mit Streptavidin-SULFO-TAG auf einem MSD-Imager zur Quantifizierung der Oligonukleotide detektiert.
Ergebnis
Wir haben eine zuverlässige und übertragbare Oligonukleotid-Testmethode für die Bioanalyse von RNA-Aptameren in verschiedenen biologischen Matrizen entwickelt. Darüber hinaus zeigten diese PK-Tests ein dosisabhängiges Profil und wurden vom Sponsor bei den Zulassungsbehörden zur Quantifizierung von Oligonukleotiden eingereicht.
Da Oligonukleotid-Aptamere einen hohen therapeutischen und diagnostischen Wert aufweisen und für die zelltypspezifische Verabreichung anderer RNA-Therapeutika (wie siRNA) besonders nützlich sind, ist ein verstärkter Impuls für die Entwicklung neuer Aptamere als Therapeutika entstanden.
Folglich kann eine robuste und reproduzierbare Oligonukleotidanalyse für PK- und TK-Untersuchungen erheblich dazu beitragen, die Arzneimittelentwicklung für diese neuen Therapeutika zu beschleunigen.
Zugelassen und geprüft durch verschiedene Aufsichtsbehörden
Wenden Sie sich bezüglich Ihres MSD-Hybridisierungs-ELISA, Ihrer Oligonukleotid-Analyse oder Ihres Oligonukleotid-Tests an unseren Wissenschaftler
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