Aufgrund ihrer komplexen Struktur lassen sich diese Wirkstoffe mit herkömmlichen Analysemethoden nur schwer trennen und nachweisen. Ihre geringe Stabilität bedeutet, dass sie während der Probenvorbereitung, Lagerung oder Analyse abgebaut werden oder ihre Wirksamkeit verlieren können. Ihre hohe Anfälligkeit für Matrixstörungen bedeutet, dass das Vorhandensein exogener oder endogener Verbindungen in biologischen Proben die Genauigkeit und Präzision der Messung beeinträchtigen kann. Daher ist eine empfindliche, selektive und robuste Analysemethode erforderlich, die diese Herausforderungen bewältigen und die an Nutzlasten gebundenen Peptide in Plasmaproben präzise quantifizieren kann.
Lösung
Es wurde eine Methode der Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC–MS/MS) entwickelt, um ein an einen Sprengkopf gebundenes Peptid im Plasma von Ratten, nicht-menschlichen Primaten (NHP) und Menschen zu analysieren. Die Methode umfasste einen einfachen Schritt zur Proteinausfällung, gefolgt von einer chromatographischen Trennung und einem Nachweis mittels eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers. Als interner Standard (IS) wurde ein mit stabilen Isotopen markiertes Peptid verwendet, um Verluste des Analyten und Matrixeffekte zu korrigieren.
Der Schritt der Proteinausfällung wurde durch Zugabe von Acetonitril zu den Plasmaproben durchgeführt. Dies führte zur Ausfällung von Proteinen und anderen Störsubstanzen, während das an den Sprengkopf gebundene Peptid und der interne Standard im Überstand verblieben. Der Überstand wurde anschließend in das LC–MS/MS-System injiziert, wo das an den Warhead gebundene Peptid und der interne Standard (IS) auf einer C18-Umkehrphasensäule mittels einer Gradientenelution mit Wasser und Acetonitril getrennt wurden, die beide 0,1 % Ameisensäure enthielten.
Die Detektion erfolgte mit dem Massenspektrometer im positiven Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI+), wobei die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) der Vorläufer und Produkte des an den Sprengkopf gebundenen Peptids sowie des internen Standards genutzt wurde. Die MRM-Übergänge wurden optimiert, um maximale Empfindlichkeit und Spezifität für den Analyten und den internen Standard zu erzielen. Das entwickelte Protokoll wurde so konzipiert, dass es einen robusten, reproduzierbaren und empfindlichen Test bietet, der für die Quantifizierung von Peptiden bei verschiedenen Tierarten geeignet ist und zur Unterstützung bioanalytischer Studien im Rahmen der präklinischen und klinischen Arzneimittelentwicklung dient.
Ergebnis
Die LC–MS/MS-Methode für das Peptid wurde gemäß den Richtlinien der US-amerikanischen FDA zur Validierung bioanalytischer Methoden erfolgreich validiert. Der Test zeigte eine ausgezeichnete Linearität, Genauigkeit, Präzision, Selektivität, Empfindlichkeit, Wiederfindbarkeit und Stabilität für das an den „Warhead“ gebundene Peptid im Plasma von Ratten, nicht-menschlichen Primaten und Menschen.
Die Kalibrierungskurven waren im Konzentrationsbereich von 0,5 bis 500 ng/ml linear, mit Korrelationskoeffizienten von über 0,99. Die Genauigkeit und Präzision der Methode erfüllten die Akzeptanzkriterien von ± 15 % für die Qualitätskontrollproben und von ± 20 % für die untere Bestimmungsgrenze des Peptids. Die Selektivität der Methode wurde durch das Fehlen jeglicher signifikanter Störungen durch Blindplasmaproben oder Plasmaproben, denen andere Arzneimittel zugesetzt worden waren, einschließlich Matrizen aus Studien an nichtmenschlichen Primaten, nachgewiesen.
Die Empfindlichkeit der Methode reichte aus, um das an den „Warhead“ gebundene Peptid bei einer unteren Bestimmungsgrenze von 0,5 ng/ml zu quantifizieren. Die Wiederfindungsrate war konstant und reproduzierbar, mit Werten zwischen 85 % und 95 % für das an den „Warhead“ gebundene Peptid und zwischen 90 % und 100 % für den internen Standard. Die Stabilität wurde unter verschiedenen Lagerungs- und Handhabungsbedingungen bestätigt, insbesondere bei Einfrier- und Auftauzyklen, bei kurz- und langfristiger Lagerung sowie bei Lagerung nach der Herstellung, ohne dass ein nennenswerter Abbau beobachtet wurde.
Die validierte Methode wurde erfolgreich zur Untermauerung pharmakokinetischer Studien sowohl im präklinischen als auch im klinischen Kontext angewendet. Die Methode hat sich bei der Quantifizierung von Peptiden in Plasmaproben als nützlich und zuverlässig erwiesen und wertvolle Informationen für die Bewertung der Sicherheit, Wirksamkeit und pharmakologischen Eigenschaften des Arzneimittels geliefert. Darüber hinaus hat sich die experimentelle LC–MS/MS-Strategie als robuste Plattform für die quantitative Analyse von Peptiden, Proteinen und zugehörigen Metaboliten erwiesen und gewährleistet somit präzise und reproduzierbare Ergebnisse in allen untersuchten Matrizen.
Von verschiedenen Zulassungsbehörden registriert und geprüft
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