Chemopreventieve middelen die gericht zijn op het verminderen van de effecten van genotoxische verbindingen zijn bijzonder interessant. Wanneer deze verbindingen reageren met DNA, vormen ze covalente modificaties, ook wel DNA-adducten genoemd, die de structuur en functie van DNA kunnen veranderen. Om de rol van DNA-adducten bij het ontstaan en de progressie van ziekten te begrijpen, is het belangrijk om ze te meten in biologische monsters, zoals bloed, urine of weefsel. Dit is het doel van DNA-adductomics, een nieuw onderzoeksgebied dat gebruikmaakt van vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS/MS) om op een uitgebreide en onbevooroordeelde manier te screenen op bekende en onbekende DNA-adducten.
DNA-adductomics is echter een uitdaging, vooral bij toepassing op celgebaseerde in-vitro-monsters, die vaak worden gebruikt om de effecten van genotoxische verbindingen op verschillende celtypen te bestuderen. Enkele uitdagingen zijn onder meer de geringe hoeveelheid en kwaliteit van het beschikbare DNA uit gekweekte cellen, de interferentie van componenten van de celkweek, zoals serumproteïnen en toevoegingen aan het kweekmedium, en de behoefte aan referentiestandaarden en spectrale bibliotheken voor de analyse van DNA-adducten.
Oplossing
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een LC–MS/MS-methode ontwikkeld, gekwalificeerd en toegepast voor het analyseren van DNA-adducten in op cellen gebaseerde in-vitro -monsters. De methode omvatte de volgende stappen:
- Isolatie van DNA uit gekweekte cellen met behulp van een commerciële kit, wat een hoge opbrengst en zuiverheid van het DNA garandeerde
- Enzymatische hydrolyse van DNA tot nucleosiden, waardoor de complexiteit van het monster werd verminderd en de gevoeligheid van de analyse werd verhoogd
- Online vaste-fase-extractie en scheiding van nucleosiden door middel van omgekeerde-fase-chromatografie, waardoor de interferentie van celkweekcomponenten werd verwijderd en een goede resolutie van de analyten werd bereikt
- Detectie en identificatie van DNA-adducten met een massaspectrometer met hoge resolutie, werkend in de modus voor positieve elektrospray-ionisatie (ESI+) en de modus voor data-onafhankelijke acquisitie (DIA), waardoor gelijktijdige acquisitie van precursor- en fragmentionenspectra voor alle analyten mogelijk was
De methode werd gekwalificeerd volgens de ‘fit-for-purpose’-benadering, waarbij de prestaties van de methode werden beoordeeld op basis van het beoogde gebruik en vooraf gedefinieerde acceptatiecriteria. De methode toonde aanvaardbare prestaties bij het detecteren en kwantificeren van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters wat betreft nauwkeurigheid, precisie, lineariteit, selectiviteit en stabiliteit.
De methode werd toegepast voor de analyse van DNA-adducten die werden geïnduceerd door verschillende genotoxische verbindingen, waaronder benzo[a]pyreen, aflatoxine B1 en aceetaldehyde, in diverse cellijnen zoals HepG2, A549 en TK6, die verschillende organen en weefsels vertegenwoordigen.
Deze versie wijzigt alleen de opmaak van de opsomming; de formulering blijft vrijwel identiek aan je originele tekst.
Resultaat
De methode bood een gevoelig en betrouwbaar hulpmiddel voor het analyseren van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters en maakte het mogelijk om het herstel van DNA-adducten en de vorming ervan in verschillende celmodellen te onderzoeken. De methode droeg ook bij aan de vooruitgang van de DNA-adductomica door nieuwe gegevens en kennis te genereren over het voorkomen en de diversiteit van DNA-adducten in biologische systemen.
De methode zou nuttig kunnen zijn voor het bestuderen van de mechanismen en gevolgen van DNA-schade door genotoxische verbindingen en voor het evalueren van de werkzaamheid en veiligheid van chemopreventieve middelen, zoals antioxidanten, polyfenolen en fytochemicaliën, die de vorming en het herstel van DNA-adducten kunnen beïnvloeden. De methode zou ook kunnen worden toegepast op andere biologische monsters, zoals menselijke weefsels of lichaamsvloeistoffen, om de blootstelling aan en het risico op DNA-schade bij menselijke populaties te beoordelen. Deze alomvattende aanpak integreert de analyse van DNA-adducten, het onderzoek naar DNA-adductomica en de evaluatie van chemopreventieve middelen, en biedt waardevolle inzichten in de mechanismen die ten grondslag liggen aan DNA-schade en mogelijke strategieën voor preventie en interventie.
Geregistreerd en gecontroleerd door diverse regelgevende instanties
Neem contact op met onze wetenschapper over uw LC-MS-assays voor DNA-adductanalyse en chemopreventieve middelen
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
TaqMan-genexpressietest, ontwikkeling van een test voor variatie in het aantal kopieën, nGLP-validatie en monsteranalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor het bepalen van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Ontwikkeling van een LC-MS-methode en GLP-validatie voor de analyse van PK-plasmamonsters
Test voor heranalyse van verzamelde monsters (ISR), FDA-vereisten en evaluatie van het onderzoek
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.