Methodevalidatie in farmacokinetische en bioanalytische onderzoeken garandeert bevindingen van hoge kwaliteit door vertekening en fouten tot een minimum te beperken. Het validatieproces omvat de beoordeling van selectiviteit, specificiteit, gevoeligheid, nauwkeurigheid, precisie, terugvinding en stabiliteit van de analyt. Wij voeren deze validaties uit op kwaliteitscontrolemonsters (QC-monsters) die zijn bereid door een medicijnvrije matrix afkomstig van menselijke vrijwilligers of dieren te verrijken met een referentieverbinding waarvan de identiteit en concentratie bekend zijn.
QC-monsters bootsen echter om verschillende redenen niet altijd de activiteit van de testverbinding in de onderzochte monsters na. Bijvoorbeeld door een gebrek aan terugvinding van de verbinding, niet-homogeniteit van het monster, de aanwezigheid van metabolieten, eiwitbinding en matrixonderdrukkende effecten, enz. Hierbij is heranalyse van de werkelijke monsters (ISR) van cruciaal belang. Een ISR-test houdt in dat werkelijke monsters opnieuw worden geanalyseerd om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de resultaten van de oorspronkelijke analyse te waarborgen.
Regelgeving
De eerste besprekingen over de noodzaak van richtlijnen voor de heranalyse van incurreerde monsters – ingegeven door de grote variabiliteit van heranalyseerde monsters ten opzichte van de oorspronkelijke resultaten in sommige studies, zoals waargenomen door de FDA – vonden plaats in mei 2006 tijdens de AAPS/FDA Bioanalytical Workshop met de titel „Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays”. Daarna kwamen vooraanstaande vertegenwoordigers uit de industrie in februari 2008 bijeen om algemene procedures voor de heranalyse van incurrede monsters te bespreken tijdens de AAPS/FDA Bioanalytical Workshop getiteld „AAPS workshop on current topics in GLP bioanalysis: Reproduceerbaarheid van testen voor Incurred-monsters – implicaties van de aanbevelingen van Crystal City”, en publiceerde vervolgens in juni 2009 verwachtingen voor de uitvoering, documentatie en rapportage van ISR-testen. Het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) gaf als eerste regelgevende richtlijnen voor ISR-analyse. De FDA volgde in 2013 met de publicatie van haar eigen ontwerpdocument.
Het ISR-mandaat van de FDA
- Vereis heranalyse van verkregen monsters (ISR) voor alle cruciale PK-/PD- en in vivo BE-studies bij mensen; ISR ten minste één keer per methode en diersoort tijdens niet-klinische veiligheidsstudies
- Neem ISR-analyse op in de pilotfase van de methodeontwikkeling en -validatie om corrigerende maatregelen mogelijk te maken vóór de cruciale studie; controleer de heranalyse van bestaande monsters in grotere aantallen en met meer variatie voor cruciale PK-/PD-studies
- Selecteer maximaal 10% van de onderzoeksmonsters voor de ISR-test
- Selecteer monsters zodanig dat het volledige PK/PD-profiel van alle proefpersonen adequaat wordt bestreken, inclusief beoordelingen vanaf tijdstippen rond Cmax en het einde van de eliminatiefase
- Analyseer met behulp van de oorspronkelijke bioanalytische methode (inclusief het aantal herhalingen en eventuele toegepaste verdunningsfactoren), en vergelijk de opnieuw geanalyseerde monsters met vers bereide kalibratiemonsters
- Ten minste tweederde (67%) van de ISR-testresultaten moet binnen 20% van de oorspronkelijke resultaten liggen voor kleine moleculen en binnen 30% van de oorspronkelijke resultaten voor grote moleculen; het procentuele verschil wordt berekend als (herhaling – oorspronkelijk) * 100 / gemiddelde
- Er geldt geen wettelijke verplichting tot aanvullende analyses indien een individueel monster niet aan de bovenstaande acceptatiecriteria voldoet; bij een aanzienlijk verschil wordt wetenschappelijk oordeel verwacht
- Stop de analyses en voer een onderzoek uit en documenteer dit, indien de heranalyse van de gebruikte monsters in het algemeen niet voldoet aan de acceptatiecriteria
- Documenteer alle evaluaties van ISR-tests om de uitvoering van het onderzoek en eventuele vervolgonderzoeken te kunnen reconstrueren
Onderzoek
We hebben een ISR-analyse uitgevoerd op het chemotherapiemedicijn capecitabine, dat wordt gebruikt bij de behandeling van vele soorten kanker, zoals borst-, colon-, rectale, maag-, slokdarm- en alvleesklierkanker. Het betreffende geneesmiddel is een rationeel ontworpen 5-fluorouracil (FU)-prodrug die de continue infusie van 5-FU nabootst, terwijl de complicaties en ongemakken van intraveneuze toediening worden vermeden. Dit antimetaboliet wordt in ongewijzigde vorm uit het maag-darmkanaal opgenomen, enzymatisch omgezet in actief 5-FU en direct in de tumor afgegeven. Daarom is een nauwkeurige meting van 5-FU door middel van heranalyse van de gebruikte monsters een essentieel onderdeel van het onderzoek.
We hebben zowel capecitabine als de metaboliet 5-FU gemeten. Voor de monstervoorbereiding hebben we standaarden en kwaliteitscontroles samengesteld die zowel de analyten als interne standaarden bevatten. Onze analisten voerden afzonderlijke LC-MS/MS-analyses uit voor de twee analyten vanwege het aanzienlijke verschil in retentietijd. Aanvankelijk slaagde de ISR-analyse voor de moederverbinding, maar mislukte deze voor de metaboliet
Tijdens de ISR-test merkten we op dat de huidige bioanalytische methode capecitabine nauwkeurig kan meten, maar dat de waargenomen 5-FU-concentraties sterk varieerden. Daarom zijn we een onderzoek gestart om de oorzaak van deze hoge variabiliteit en de verhoogde concentratie van 5-FU te achterhalen. Merk op dat het prodrug niet direct tot 5-FU wordt gemetaboliseerd, maar een tussenstadium doorloopt, zoals opgemerkt.
Capecitabine à 5’-deoxy-5-fluorocytidine (5’-DFCR) à 5’-deoxy-5-fluorouridine (5’-DFUR) à 5-FU
Daarnaast zijn er specifieke enzymen betrokken bij al deze omzettingen
- Carboxylesterase in de lever (5’-DFCR)
- Cytidine-deaminase in de lever en het tumorweefsel (5’-DFUR)
- Thymidinefosforylase (TP) in tumorweefsel (5-FU)
Daarom was het noodzakelijk om andere tussenliggende metabolieten te meten om het probleem te begrijpen. We hebben verschillende experimenten uitgevoerd om de reden te achterhalen waarom de heranalyse van de 5-FU-monsters mislukte. Dit was voornamelijk te wijten aan de verdere omzetting van ook andere tussenliggende metabolieten in 5-FU, wat resulteerde in aanzienlijk hogere concentraties ervan tijdens de ISR-test.
Conclusie
We constateerden dat capecitabine en 5'-DFCR onstabiel zijn in bloed en in plasma, zowel op ijs als bij 37 °C. 5'-DFUR is onstabiel in bloed, maar stabiel in plasma. Bovendien zagen we een toename van de concentratie van 5'-DFUR in plasma, wat wijst op omzetting vanuit capecitabine en 5'-DFCR. Daarom concluderen we dat meerdere mechanismen moeten bijdragen aan de toename van de concentratie van 5-FU in klinische monsters. In vivo is dus een positieve vertekening in de richting van 5-FU mogelijk als gevolg van de instabiliteit van capecitabine en de andere tussenliggende metabolieten.
NorthEast Biolab ondersteunt ISR voor zowel preklinische als klinische studies. Onze ISR-aanbevelingen omvatten First-in-human, First-in-patient, geneesmiddel-geneesmiddelinteracties, kwetsbare populaties, bio-equivalentie/biovergelijkbaarheid, eerste gebruik van een methode en pivotale studies. Ons team volgt standaardwerkprocedures (SOP’s) voor het uitvoeren, rapporteren en onderzoeken van ISR-bevindingen. We herzien en actualiseren deze SOP’s regelmatig om te voldoen aan de verwachtingen van regelgevende instanties en klanten en om betrouwbare, hoogwaardige gegevens te leveren.
- Viswanathan CT1, Bansal S, Booth B, DeStefano AJ, Rose MJ, Sailstad J, Shah VP, Skelly JP, Swann PG, Weiner R, Validatie en implementatie van kwantitatieve bioanalytische methoden: beste praktijken voor chromatografische en ligandbindingsassays, Pharm Res. oktober 2007;24(10):1962-73. Epub 26 april 2007
- Fast DM, Kelley M, Viswanathan CT, O’Shaughnessy J, King SP, Chaudhary A, Weiner R, DeStefano AJ, Tang D, Workshopverslag en follow-up – AAPS-workshop over actuele onderwerpen in GLP-bioanalyse: reproduceerbaarheid van testen voor verkregen monsters – implicaties van de aanbevelingen van Crystal City, AAPS J. juni 2009;11(2):238-41. doi: 10.1208/s12248-009-9100-9. Epub 21 april 2009.
- Chintala, L., Vaka, S., Baranda, J. et al. Oncol Rev (2011) 5: 129. https://doi.org/10.1007/s12156-011-0074-3
Geregistreerd en gecontroleerd door diverse regelgevende instanties
Praat met onze wetenschapper over uw uitdagingen bij heranalyses van monsters (ISR)
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
TaqMan-genexpressietest, ontwikkeling van een test voor variatie in het aantal kopieën, nGLP-validatie en monsteranalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor het bepalen van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels
LC-MS-methode voor de analyse van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Ontwikkeling van een LC-MS-methode en GLP-validatie voor de analyse van PK-plasmamonsters
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.