De concentratie van het aminozuur proline en hydroxyproline in biologische monsters, zoals bloed, urine of weefsel, kan de status van het collageenmetabolisme en de collageenomzet weerspiegelen en kan worden gebruikt als indicator voor fysiologische en pathologische aandoeningen, zoals veroudering, ontstekingen en kanker. De analyse van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels brengt echter verschillende analytische uitdagingen met zich mee, zoals de lage concentratie van deze aminozuren in de weefselmatrix, de hoge polariteit van deze aminozuren waardoor ze moeilijk vast te houden en te scheiden zijn met conventionele omgekeerde-fasechromatografie, de interferentie door andere aminozuren en aan peptiden gebonden vormen van proline en hydroxyproline, die de nauwkeurigheid en specificiteit van de meting kunnen beïnvloeden,
en de aanwezigheid van verschillende endogene concentraties proline en hydroxyproline in diverse weefsels, zoals lever, nier, long en hart, wat de nauwkeurige kwantificering nog complexer maakt. Daarom is er behoefte aan een gevoelige, selectieve en betrouwbare methode om proline en hydroxyproline in muizenweefsels te kwantificeren, wat kan helpen bij het ophelderen van de rol en regulatie van deze aminozuren in de collageensynthese en -afbraak en hun betrokkenheid bij diverse ziekteprocessen. Hier biedt hydrofiele interactie-vloeistofchromatografie (HILIC) een veelbelovende aanpak vanwege haar
Oplossing
Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een methode op basis van vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC–MS/MS) ontwikkeld en gevalideerd voor het kwantificeren van proline-aminozuren en hydroxyproline in muizenweefsels. De methode omvatte de volgende stappen:
- Homogenisatie van het weefsel en zure hydrolyse van het weefsel, waardoor de vrije aminozuren uit de weefselmatrix en de aan peptiden gebonden vormen van proline en hydroxyproline vrijkwamen
- Een tijdsverlooponderzoek, waarmee de optimale hydrolyseduur voor elk weefseltype werd bepaald op basis van de maximale terugvinding van proline-aminozuren en hydroxyproline
- Eiwitprecipitatie met acetonitril, waardoor de eiwitten en andere storende stoffen uit het hydrolysaat werden verwijderd
- Verdunning van het supernatant met water, waardoor de samenstelling van het oplosmiddel en de concentratie van de analyten werden aangepast voor injectie in het LC–MS/MS-systeem;
- Chromatografische scheiding op een HILIC-kolom (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), waarbij de polaire aminozuren werden vastgehouden en gescheiden door middel van een gradiëntelutie van acetonitril en water met 0,1% mierenzuur
- Detectie en kwantificering van het proline-aminozuur en hydroxyproline met een massaspectrometer, die werkte in de positieve elektrospray-ionisatiemodus en de multiple reaction monitoring-modus, waarmee de specifieke precursor- en productionen voor elke analyt werden geselecteerd en gemeten
- Gebruik van een mengsel van aminozuren als interne standaard, waarmee het matrixeffect en de variabiliteit in de monstervoorbereiding en analyse werden gecompenseerd, en dat een unieke interne standaard opleverde die de veranderingen in de concentratie van beide analyten nauwkeurig weerspiegelde en een lineaire respons vertoonde met de concentratie van proline en hydroxyproline.
Onze alomvattende aanpak garandeert dus een nauwkeurige en betrouwbare kwantificering in de prolinebepaling, waarmee de uitdagingen bij het analyseren van deze aminozuren in muizenweefsels worden overwonnen. De hypothese is dat verstoringen in de collageensynthese, vaak gekenmerkt door veranderingen in het metabolisme van het proline-aminozuur en hydroxyproline, verband houden met invaliderende aandoeningen, waaronder fibrose en bindweefselaandoeningen. Dankzij de nauwkeurigheid van onze methode bij het meten van deze aminozuren kunnen onderzoekers dieper ingaan op de onderliggende mechanismen van collageengerelateerde ziekten en mogelijke therapeutische interventies verkennen om de collageensyntheseroutes te beïnvloeden en zo het menselijk lijden te verlichten.
Resultaat
De methode werd gevalideerd volgens de richtlijnen van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor bioanalytische methoden en toonde een goede nauwkeurigheid, precisie, lineariteit, selectiviteit, terugvinding, matrixeffect en stabiliteit aan bij het meten van het proline-aminozuur en hydroxyproline in muizenweefsels, cruciale componenten voor de collageensynthese. De methode maakte gebruik van hydrofiele interactie-vloeistofchromatografie (HILIC) als robuuste scheidingstechniek. Deze chromatografische benadering leverde een uitstekende resolutie en piekvorm op voor proline en hydroxyproline, wat een nauwkeurige kwantificering mogelijk maakte.
De techniek werd gebruikt om te onderzoeken hoe de concentraties van de vrije aminozuren proline en hydroxyproline variëren in verschillende longweefsels van muizen – zoals normaal, ontstoken, fibrotisch en tumorweefsel – waarbij hydrofiele interactie-vloeistofchromatografie werd ingezet voor een goede scheiding van de verbindingen. De chromatografische techniek was ons belangrijkste hulpmiddel voor het detecteren van de aminozuren proline en hydroxyproline op micromolaire niveaus. De gevoeligheid en toepasbaarheid van HILIC voor het analyseren van deze analyten in complexe biomatrices werden eveneens aangetoond.
De methode bracht significante verschillen aan het licht in de concentratie en verhouding van proline en hydroxyproline tussen verschillende weefseltypen, wat wijst op veranderingen in het collageenmetabolisme en de collageenomzet bij verschillende ziektebeelden. De proline-bepalingsmethode zou kunnen helpen bij het bestuderen van de rol en regulatie van het proline-aminozuur en hydroxyproline in muismodellen van diverse ziekten, zoals ontstekingen, fibrose en kanker, en bij het evalueren van het effect van therapeutische interventies op de collageensynthese en -afbraak. De proline-bepalingsmethode zou ook kunnen worden uitgebreid naar andere weefseltypen, zoals lever, nier en hart, en naar andere biologische monsters, zoals bloed en urine, om de blootstelling aan en het risico van het aminozuur proline en hydroxyproline bij muizenpopulaties te beoordelen.
Geregistreerd en gecontroleerd door diverse regelgevende instanties
Neem contact op met onze wetenschapper over de ontwikkeling van uw PK-ELISA-immunoassay met monoklonale antilichaamfragmenten, GLP-validatie en MAb-bioanalyse
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
TaqMan-genexpressietest, ontwikkeling van een test voor variatie in het aantal kopieën, nGLP-validatie en monsteranalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor de analyse van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Ontwikkeling van een LC-MS-methode en GLP-validatie voor de analyse van PK-plasmamonsters
Test voor heranalyse van verzamelde monsters (ISR), FDA-vereisten en evaluatie van het onderzoek
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.