Monstervoorbereiding en vloeistofchromatografie worden soms over het hoofd gezien tijdens de ontwikkeling en validatie van LC-MS-methoden, gezien de zeer selectieve Multiple Reaction Monitoring (MRM) in LC-MS/MS-analyses. Voor een robuuste methode moeten we echter aandacht besteden aan alle stappen van monsteropschoning en chromatografie. Bovendien waarborgt deze aanpak de betrouwbaarheid en minimaliseert het de noodzaak tot bijsturing bij de overgang van het ene onderzoek naar het andere, tot en met de klinische ontwikkeling.
Bij de ontwikkeling en validatie van LC-MS-methoden is er in de vroege stadia van de geneesmiddelenontwikkeling doorgaans slechts beperkte informatie over het metabolisme van het geneesmiddel beschikbaar. Het geneesmiddel en zijn metaboliet kunnen in de massaspectrometer op vergelijkbare wijze worden verwerkt als het sterk wordt gemetaboliseerd. Dit zorgt voor complexiteit, aangezien de massaspectrometer geen onderscheid kan maken tussen twee entiteiten met dezelfde massa en hetzelfde dochterion. Daarom is het scheiden van deze analyten via een LC-MS/MS-test essentieel om interferentie door metabolieten te voorkomen.
Het gebruik van het brede scala aan validatieprotocollen voor LC-MS-methoden zorgt voor de duurzaamheid van de methode, beschermt de geloofwaardigheid ervan en vermindert daarmee de noodzaak om concessies te doen aan de techniek bij de overgang van de ene klinische studie naar de andere, met name in de klinische ontwikkelingsfasen.
Daarentegen bieden ELISA-testmethoden of immunoassay-diensten, hoewel waardevol in bepaalde contexten, mogelijk niet hetzelfde niveau van specificiteit en selectiviteit als LC-MS/MS-analyses. Immunoassays zijn zeer gevoelig voor specifieke antigenen of antilichamen en zijn nuttig voor het kwantificeren van grote moleculen zoals eiwitten of peptiden. Immunoassay-diensten zijn echter mogelijk niet geschikt voor het kwantificeren van kleine moleculen zoals geneesmiddelen en hun metabolieten, met name in complexe biologische matrices waar kruisreactiviteit en interferentie problemen opleveren. Daarom worden LC-MS/MS-analyses voornamelijk toegepast vanwege hun vermogen om nauwkeurige en betrouwbare kwantificatiegegevens te leveren, waar vooral in de vroege stadia van de geneesmiddelenontwikkeling veel vraag naar is, wanneer er nog weinig informatie over het metabolisme van het geneesmiddel beschikbaar is.
Kwaliteit en naleving
Volgens de FDA-richtlijnen moet de ontwikkeling en validatie van een LC-MS -methode voor een bioanalytische test het volgende omvatten:
- i) precisie
- ii) nauwkeurigheid
- iii) selectiviteit
- iv) specificiteit
- v) Stabiliteit
We beschikken over praktische, diepgaande ervaring in de ontwikkeling en validatie van LC-MS/MS-methoden, opgedaan tijdens honderden GLP- en niet-GLP-bioanalytische onderzoeken. Bovendien is onze auditgeschiedenis bij regelgevende instanties en inspecteurs van klanten vrijwel onberispelijk. Al in 2016 hebben we met succes de opmerkingen uit FDA-audits afgehandeld en hierop gereageerd. Uiteindelijk hechten we veel waarde aan goede wetenschap en hoge kwaliteit, bereikt door een zorgvuldige combinatie van selectieve en gevoelige chromatografie met massaspectrometrie (LC-MS/MS-test).
Daarom hebben wij de ontwikkeling van LC-MS/MS-methoden tot ons belangrijkste instrument voor het uitvoeren van bioanalyses gemaakt. Daarnaast voegen wij ELISA-testmethoden en immunoassay-diensten toe aan ons concurrerende aanbod, waardoor wij onze professionele status versterken. Deze ondersteunende diensten vormen een integraal onderdeel van onze dienstverlening als bioanalytische contractorganisatie die zich inzet voor het bieden van oplossingen op maat. Met onze synergie tussen ELISA-testmethoden, immunoassay-diensten en onze expertise op het gebied van LC-MS-methodeontwikkeling en -validatie garanderen wij de vereiste holistische oplossing voor de uitdagingen die zich voordoen bij basisanalyses, waardoor klanten en de wetenschappelijke gemeenschap kunnen vertrouwen op de kwaliteit van de resultaten en onze uitmuntendheid.
Casus
In dit geval vroeg een van onze klanten hulp bij de ontwikkeling, optimalisatie en validatie van een LC-MS-methode. Tijdens de monsteranalyse merkten we dat er een kleine piek verscheen als een ‘schouder’ naast de piek van de analyt. De betreffende analyt had een retentietijd van 1,5 minuten. Onze experimentele aanpak verlengde die retentietijd en scheidde de piek van de analyt van het endogene materiaal dat eerder elueerde, aangezien de LC-MS-monstervoorbereiding gebaseerd was op eiwitprecipitatie. We streefden ernaar dit te bereiken door de chromatografische omstandigheden aan te passen, waaronder het gebruik van een andere mobiele fase en andere kolommen. Onze wetenschappers bevestigden dat dit geen gesplitste piek was als gevolg van onjuiste chromatografie of interferentie in het controleplasma, maar veeleer te wijten was aan een andere verbinding met dezelfde MS-overgang. Daarom stelden we de hypothese op en begonnen we te onderzoeken of dit probleem te wijten was aan een metaboliet met een vergelijkbare overgang.
Tijdens dit onderzoek hebben we ook de mogelijkheid onderzocht om een ELISA-testmethode of immunoassay-diensten in te zetten als aanvulling op de LC-MS/MS-test. Deze methoden zouden extra specificiteit en gevoeligheid kunnen bieden, met name bij het detecteren en kwantificeren van de doelanalyte en mogelijke interfererende verbindingen. We gaven echter in eerste instantie prioriteit aan het optimaliseren van de ontwikkeling van de LC-MS-methode om de waargenomen piekinterferentie aan te pakken, aangezien deze methode directe kwantificering en identificatie van de analyt en mogelijke metabolieten bood. Niettemin zou het in toekomstige studies overwogen kunnen worden om aanvullende technieken, zoals de ELISA-testmethode of immunoassay-diensten, in te zetten om de analytische robuustheid en nauwkeurigheid van de analyse te verbeteren.
De validatie van de LC-MS-methode en de monstervoorbereiding voor LC-MS zijn essentiële onderdelen van onze aanpak om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van onze analysemethoden te waarborgen.
Tijdens het scheiden van de twee pieken via de validatie van de LC-MS-methode, stelden we vast dat de intensiteit van de storende piek van monster tot monster varieerde. Hieruit bleek dat de ruis afkomstig was van een metaboliet. We schatten verder in dat deze metaboliet een glucuronideconjugaat was, aangezien de betreffende piek eerder elueerde dan de analyten. We beschikten op dat moment echter niet over een referentiestandaard voor glucuronide. Uiteindelijk hebben we bevestigd dat deze piek een glucuronideconjugaat was, na onderzoek van de plasmamonsters met behulp van enzymatische hydrolyse. Daardoor hebben we de methode met succes gevalideerd en toegepast voor de analyse van plasmamonsters.
Hoewel we ons hebben gericht op de ontwikkeling, optimalisatie en validatie van LC-MS-methoden, bieden we ook diensten aan op het gebied van de ontwikkeling van ELISA-testmethoden en immunoassays om tegemoet te komen aan de uiteenlopende behoeften van klanten op het gebied van bioanalytisch onderzoek.
Conclusie
Het glucuronideconjugaat van de analyt was aanwezig in klinische monsters en chromatografische scheiding was essentieel om deze interferentie te voorkomen.
De ontwikkeling en validatie van LC-MS/MS-methoden zijn uitstekende hulpmiddelen voor selectiviteit, maar we mogen geen concessies doen aan de monsteropschoning en de chromatografische scheiding. We moeten een redelijke retentietijd toestaan om vroeg eluerende endogene verbindingen en metabolieten van de analyt te scheiden.
NorthEast Biolab biedt een uitgebreid pakket aan bioanalytische diensten, waaronder het volgende:
- Ontwikkeling, validatie en analyse van klinische LC-MS/MS-methoden
- Niet-klinische bioanalytische ondersteuning voor LC-MS/MS, waaronder onderzoeken naar het doseringsbereik (DRF)
- GLP-toxicologische methodeontwikkeling, validatie en analyse
Naast de ontwikkeling en validatie van LC-MS/MS-methoden bieden wij ook de ontwikkeling van ELISA-testmethoden en immunoassay-diensten aan. Ons team volgt standaardwerkprocedures (SOP's) voor het ontwikkelen, optimaliseren en valideren van bioanalytische methoden. We herzien en actualiseren deze SOP's regelmatig om te voldoen aan de regelgeving en de verwachtingen van onze klanten en om betrouwbare, hoogwaardige gegevens te leveren.
Bij de ontwikkeling van LC-MS-methoden geven we prioriteit aan een robuuste chromatografische scheiding om interferenties, zoals het metaboliet glutacuronideconjugaat, te vermijden. Onze ontwikkelings- en validatieprocessen voor LC-MS-methoden garanderen een nauwkeurige en betrouwbare kwantificering van analyten in complexe matrices. Daarnaast zijn wij gespecialiseerd in LC-MS-monstervoorbereidingstechnieken om de gevoeligheid te verhogen en matrixeffecten te minimaliseren, waardoor uiteindelijk de prestaties van de methode en de gegevenskwaliteit worden geoptimaliseerd.
Neem contact op met onze wetenschapper over uw LC-MS-analyses voor DNA-adductanalyse en chemopreventieve middelen
Geregistreerd en geïnspecteerd door diverse regelgevende instanties
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
TaqMan-genexpressietest, ontwikkeling van een test voor variatie in het aantal kopieën, nGLP-validatie en monsteranalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor het bepalen van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels
LC-MS-methode voor de analyse van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Test voor heranalyse van verzamelde monsters (ISR), FDA-vereisten en evaluatie van het onderzoek
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.