Er werd real-time PCR-genexpressie, of qRT-PCR-genexpressie, of qPCR-analyse van genexpressie uitgevoerd op meerdere leden van de Wnt/β-catenine-signaalroute en hun stroomafwaartse doelwitten. Meer specifiek werden differentiële genexpressieanalyses, qPCR-expressieanalyses en ddPCR-genexpressie uitgevoerd op differentieel tot expressie gebrachte genen zoals Wnt Family member 16 (Wnt16), Lymphoid Enhancer-Binding Factor (LEF1), Melanogenesis Associated Transcription Factor (MITF), SRY-box 10 (SOX10), de adhesiemarkers β-catenine-1 (CTNNB1), cadherine 1 (CDH1) en de proteasen matrixmetalloproteïnase-9 (MMP-9).
De genexpressieprofilering omvatte ook meerdere housekeeping-genen, zoals RNA-polymerase II-subeenheid A (POLR2A), eukaryotisch 18S rRNA (18S), actine-bèta (ACTB) en ribosomaal eiwit laterale stalk-subeenheid P0 (RPLP0) werden als controlegenen geanalyseerd. Sommige van deze differentieel tot expressie gebrachte genen vertonen variatie in het aantal kopieën en lage expressieniveaus, wat uitdagingen oplevert bij nauwkeurige kwantificering. Daarom werden differentiële genexpressieanalyse, analyse van het aantal kopieën en een test op variatie in het aantal kopieën uitgevoerd om een nauwkeurige kwantificering van de genexpressieniveaus te waarborgen en rekening te houden met eventuele variaties in het aantal kopieën tussen monsters.
Oplossing
Er werd een TaqMan-genexpressietest gebruikt om de expressieniveaus van deze differentieel tot expressie gebrachte genen te optimaliseren en te kwantificeren in beperkte hoeveelheden menselijke biologische matrices die via biopsie waren verkregen. Vanwege de beperkte monsterhoeveelheid en de grote variatie in de expressie van de doel- en housekeeping-genen werd eerst een zorgvuldige en grondige optimalisatie uitgevoerd op de kwantitatieve real-time PCR-genexpressie (qPCR), alvorens de genexpressie te kwantificeren op het digitale PCR (ddPCR)-genexpressieplatform.
Deze complexe optimalisatiemethode omvat het opzetten van qRT-PCR-genexpressie-experimenten met serieel verdund complementair DNA (cDNA) om een standaardcurve te genereren voor het evalueren van de amplificatie-efficiëntie van primers/probes, een cruciale stap in qPCR-expressieanalyse. Over het geheel genomen is de precisie bij de qPCR-analyse van genexpressie van cruciaal belang om de betrouwbaarheid van onze bevindingen in dit onderzoek met een beperkt aantal monsters te waarborgen. Deze aanpak is cruciaal voor een nauwkeurige analyse van het kopieaantal en het onderzoek naar variaties in het kopieaantal, vooral bij beperkte monsterhoeveelheden en variaties in het kopieaantal op het niveau van genexpressie. Dit proces is essentieel voor het analyseren van differentieel tot expressie gebrachte genen en het opstellen van genexpressieprofielen, waardoor nauwkeurige en betrouwbare resultaten bij differentiële genexpressieanalyse worden gewaarborgd.
Om de beperkte hoeveelheid RNA te ondervangen, hebben we gebruikgemaakt van dPCR (QuantStudio Absolute Q Digital PCR System) voor de genexpressieanalyse van differentieel tot expressie gebrachte genen. In tegenstelling tot qRT-PCR-genexpressieanalyse, die berust op real-time PCR-technologie, omvat ddPCR-genexpressie het opsplitsen van een monster in real-time PCR-reacties. Sommige reacties bevatten het doelmolecuul (positief), terwijl andere dat niet doen (negatief). Om een naadloze overgang van qPCR naar ddPCR te garanderen, vormde de initiële qPCR-analyse van genexpressie een solide basis voor nauwkeurige metingen in onze experimenten.
Nadat de PCR-amplificatie is voltooid, wordt de negatieve fractie gebruikt om op een digitaal PCR-platform met behulp van Poisson-statistiek en -analyse een absolute hoeveelheid te genereren voor het exacte aantal doelmoleculen in het monster. Deze methode vergemakkelijkt differentiële genexpressieanalyse en kopieaantalanalyse en biedt verschillende voordelen ten opzichte van qPCR-expressieanalyse. In tegenstelling tot qPCR vereist ddPCR-genexpressie geen bekende standaarden of referenties, en worden de resultaten weergegeven als kopieaantallen, wat helpt bij het opstellen van genexpressieprofielen en het uitvoeren van kopieaantalvariatie-assays.
Resultaat
We hebben een betrouwbare en overdraagbare TaqMan-genexpressietestmethode ontwikkeld voor genexpressieanalyse van doelgenen in een beperkte biologische matrix, zoals een huidbiopsie. Na optimalisatie van de qPCR-expressieanalyse werden real-time PCR-genexpressietests gebruikt om het kopieaantal van doelgenen en housekeeping-genen te kwantificeren, wat een nauwkeurige analyse van het kopieaantal mogelijk maakt. Deze aanpak vergemakkelijkt de identificatie van differentieel tot expressie gebrachte genen en maakt het opstellen van genexpressieprofielen mogelijk, waardoor een uitgebreide analyse van genetische variaties en de implicaties daarvan mogelijk is.
Aangezien genexpressieniveaus (biomarkers) van grote diagnostische en therapeutische waarde zijn gebleken, is qRT-PCR-genexpressieanalyse essentieel. Het ddPCR-genexpressieplatform ontpopt zich als een waardevoller hulpmiddel voor de kwantificering van analyten en robuuste bioanalyse van meerdere biomarkers met hoge nauwkeurigheid en precisie, waarbij slechts een kleine hoeveelheid of een klein volume monster nodig is. Dit maakt het ideaal voor differentiële genexpressieanalyse, kopieaantalanalyse en kopieaantalvariatietests in diverse biologische monsters.
Geregistreerd en gecontroleerd door diverse regelgevende instanties
Neem contact op met onze wetenschapper over de ontwikkeling van uw kwantitatieve PCR- en digitale PCR TaqMan-genexpressietests, nGLP-validatie en monsteranalyse
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor het bepalen van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels
LC-MS-methode voor de analyse van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Ontwikkeling van een LC-MS-methode en GLP-validatie voor de analyse van PK-plasmamonsters
Test voor heranalyse van verzamelde monsters (ISR), FDA-vereisten en evaluatie van het onderzoek
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen wij organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.