Het geneesmiddel was ontworpen om tegelijkertijd twee cytokine-doelwitten te binden, en deze dubbele bindingsarchitectuur zorgde voor een reeks samengestelde bioanalytische uitdagingen die niet konden worden aangepakt met standaardtestmethoden voor één doelwit. Elk type test vereiste een onafhankelijke ontwikkelingsstrategie die was afgestemd op de structurele en farmacologische eigenschappen van het bispecifieke molecuul.
Voor de ontwikkeling van de PK-test was de belangrijkste eis het realiseren van voldoende gevoeligheid om de geneesmiddelconcentraties in zowel de lage- als de hoge-dosiscohorten nauwkeurig vast te leggen binnen één enkele analytische run. Het inherent brede dosisbereik van het klinische programma vereiste een lang dynamisch kwantificatiebereik zonder dat dit ten koste ging van de prestaties op het gebied van de ondergrens van kwantificatie (LLOQ). Bovendien vertoonde de test matrixintolerantie bij standaardverdunningsfactoren, een veelvoorkomend obstakel bij complexe biologische matrices, waardoor zorgvuldige bufferoptimalisatie noodzakelijk was om de integriteit van de test te behouden en tegelijkertijd te voldoen aan de wettelijke gevoeligheidseisen. Het bereiken van de beoogde gevoeligheid in de lage-doseringsgroepen, terwijl de kwantitatieve nauwkeurigheid in monsters met hoge doseringen binnen één enkele gevalideerde methode behouden bleef, vormde een fundamentele ontwerpbeperking.
De ADA-test vormde een specifieke en klinisch relevante uitdaging: het ontwikkelen van een ADA-test die tolerant is ten opzichte van circulerende geneesmiddelconcentraties tot 300 µg/mL. Hoge geneesmiddelconcentraties op het moment van bemonstering komen vaak voor in klinische onderzoeken, met name tijdens en kort na toediening, en kunnen ADA-signalen maskeren of onderdrukken in standaard immunogeniciteitstests met overbruggingsformaten. Het bereiken van voldoende medicijntolerantie zonder afbreuk te doen aan de gevoeligheid voor ADA met een lage titer – wat zelfs bij lage concentraties klinisch relevant kan zijn – vereiste een fundamenteel aangepaste strategie voor monstervoorbereiding die verder ging dan conventionele benaderingen op basis van zuurdissociatie.
Voor de metingen van de doelbinding in de farmacodynamische test eiste de opdrachtgever dubbele doelbindingsbeoordelingen voor beide interleukine-doelen van het bispecifieke molecuul. Het ontwikkelen van een assay voor aan het geneesmiddel gebonden cytokines waarmee de binding aan het doelwit in aanwezigheid van circulerend bispecifiek antilichaam kan worden gekwantificeerd, bleek bijzonder complex, aangezien sterische hindering door een overmaat aan vrij geneesmiddel en heterofiele interacties tussen assaycomponenten de signaaldetectie belemmerden. Conventionele strategieën voor antilichaamcapture konden zonder uitgebreide optimalisatie onvoldoende gevoeligheid en specificiteit bereiken, en zowel de selectie van het capture-antilichaam als de formulering van het testverdunningsmiddel vereisten herhaaldelijk herontwerp om deze door de matrix veroorzaakte interferenties te overwinnen.
Oplossing
Voor de ontwikkeling van de PK-test werd een sandwich-immunoassay-formaat opgezet, waarbij gebruik werd gemaakt van een testconfiguratie met een anti-geneesmiddel-antilichaam, waarbij het anti-geneesmiddel-antilichaam als vangreagens fungeerde en een anti-menselijk IgG1-antilichaam voor de detectie. Deze configuratie werd specifiek gekozen om de bindingsspecificiteit te behouden over het volledige kwantificatiebereik dat vereist is voor klinische monitoring bij meervoudige dosering. Door middel van reagensscreening en herhaaldelijke optimalisatie werd een gevalideerde gevoeligheid van 50,00 ng/mL bereikt, met een bovenste kwantificatielimiet van 6400,00 ng/mL, wat een dynamisch bereik van 128-voud opleverde. De minimaal vereiste verdunning (MRD) om matrixinterferentie te beperken werd systematisch gecontroleerd door een MRD van 1:30 toe te passen in een gespecialiseerde testbuffer, waardoor matrixeffecten effectief werden onderdrukt zonder het gevalideerde bereik bij verwachte klinische concentraties in gevaar te brengen.
Voor de beoordeling van de immunogeniciteit werd de BEAD-methodologie voor geneesmiddelstolerantie (ADA), Biotin Drug Extraction and Acid Dissociation, toegepast als strategie voor monstervoorbereiding om ADA-immuuncomplexen van het geneesmiddel onder zure omstandigheden te dissociëren, waardoor de vrijgekomen ADA zich tijdens de daaropvolgende neutralisatiestap opnieuw kan binden aan het met biotine gemerkte geneesmiddel. Deze op BEAD gebaseerde voorbehandeling werd geïntegreerd in een overbruggende elektrochemiluminescentie (ECL)-testopzet, en door iteratieve optimalisatie van de parameters voor zuurdissociatie en de reagensconcentraties werd de test verbeterd tot een geneesmiddeltolerantie van maximaal 1000 µg/mL bij een positieve controleconsentratie van 100 ng/mL, waarmee de klinische eis van de opdrachtgever van 300 µg/mL ruimschoots werd overtroffen en een ruime veiligheidsmarge werd geboden voor monsters die bij maximale geneesmiddelblootstelling werden afgenomen.
Voor de PD-beoordeling werd voor elk interleukine-doelwit een test voor aan geneesmiddelen gebonden cytokines ontwikkeld om biomarkers voor doelwitbinding te meten in aanwezigheid van circulerend bispecifiek antilichaam. Een gestructureerde antilichaam-screeningcampagne identificeerde capture-antilichamen die in staat waren om toegang te krijgen tot hun respectieve epitopen op aan geneesmiddelen gebonden cytokine-complexen, ondanks sterische blokkade door het bispecifieke molecuul. Er werd een immunoteststrategie met heterofiele blokkers toegepast, waarbij heterofiele blokkerende reagentia in het testverdunningsmiddel werden opgenomen, om niet-specifieke signaalbijdragen van endogene immunoglobulinen en kruisreactieve matrixcomponenten te onderdrukken, waardoor de gevoeligheid en specificiteit werden hersteld die nodig zijn om farmacodynamische modulatie binnen de verwachte klinische concentratiebereiken te detecteren.
Resultaat
We hebben een compleet bioanalytisch pakket ontwikkeld en gevalideerd, bestaande uit PK-, ADA- en dubbele PD-testen, ter ondersteuning van deze klinische studie met een bispecifiek antilichaam gericht tegen interleukine. De PK-test leverde een gevalideerd kwantificatiebereik op van 50,00–6400,00 ng/mL met aangetoonde matrixcompatibiliteit bij een minimaal vereiste verdunning van 1:30, waardoor betrouwbare gegevens over de geneesmiddelconcentratie werden verkregen voor alle dosiscohorten. De ADA-test bereikte een geneesmiddelstolerantie die de klinische drempel aanzienlijk overschreed, waardoor immunogeniciteitsbeoordelingen geldig blijven, zelfs bij hoge concentraties van het geneesmiddel in de bloedbaan. De twee PD-testen voor doelbinding wisten sterische interferentie en matrixgerelateerde uitdagingen succesvol te overwinnen, waardoor de detectie van aan het geneesmiddel gebonden cytokine-complexen mogelijk werd, wat farmacodynamische meetresultaten opleverde die direct relevant zijn voor het bispecifieke werkingsmechanisme.
Al met al weerspiegelt dit bioanalytische programma het vermogen van NorthEast BioLab om de toegenomen complexiteit van bispecifieke antilichaamtherapieën aan te pakken, die gecoördineerde immunoassay-strategieën vereisen die veel verder gaan dan benaderingen met één doelwit. De gegevens die met alle drie de testtypes zijn gegenereerd, leveren informatie op voor de dosiskeuze, de beoordeling van het immunogeniciteitsrisico en de farmacodynamische proof-of-concept-evaluatie naarmate het programma vordert in de klinische ontwikkeling.
De ontwikkeling en validatie van immunogeniciteitstests en de ontwikkeling van PK-methoden voor bispecifieke geneesmiddelen vereisen platformexpertise die veel verder reikt dan standaardprogramma’s voor grote moleculen. Het is essentieel om in een vroeg stadium een toegewijd bioanalytisch CRO-team voor klinische proeven in te schakelen, dat PK-, ADA- en PD-strategieën parallel kan opzetten, om de gegevenskwaliteit en naleving van de regelgeving te waarborgen. Door alle methoden vanaf dag één af te stemmen op de FDA-richtlijnen voor de validatie van bioanalytische methoden, worden kostbare herwerkingen voorkomen en blijft het programma op schema voor de indiening bij de regelgevende instanties.
Geregistreerd en geïnspecteerd door diverse regelgevende instanties
Praat met onze wetenschapper over uw multiplex cytokine-assay en cytokinekwantificatie bij Meso Scale Discovery
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
TaqMan-genexpressietest, ontwikkeling van een test voor variatie in het aantal kopieën, nGLP-validatie en monsteranalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor het bepalen van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels
LC-MS-methode voor de analyse van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Ontwikkeling van een LC-MS-methode en GLP-validatie voor de analyse van PK-plasmamonsters
Test voor heranalyse van verzamelde monsters (ISR), FDA-vereisten en evaluatie van het onderzoek
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.