Door hun complexe structuur zijn deze geneesmiddelen moeilijk te scheiden en te detecteren met conventionele analysemethoden. De lage stabiliteit van deze geneesmiddelen betekent dat ze tijdens de monstervoorbereiding, opslag of analyse kunnen afbreken of hun activiteit kunnen verliezen. De hoge gevoeligheid voor matrixinterferentie houdt in dat de aanwezigheid van exogene of endogene verbindingen in de biologische monsters de nauwkeurigheid en precisie van de meting kan beïnvloeden. Daarom is er behoefte aan een gevoelige, selectieve en robuuste analysemethode die deze uitdagingen kan overwinnen en de peptiden die aan payloads zijn gekoppeld in plasmamonsters nauwkeurig kan kwantificeren.
Oplossing
Er werd een methode met vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC–MS/MS) ontwikkeld om een peptide te analyseren dat aan een warhead is gekoppeld in plasma van ratten, niet-menselijke primaten (NHP) en mensen. De methode omvatte een eenvoudige stap voor eiwitprecipitatie, gevolgd door chromatografische scheiding en detectie met behulp van een triple-quadrupoolmassaspectrometer. Een met stabiele isotopen gemerkt peptide werd gebruikt als interne standaard (IS) om te corrigeren voor verliezen van de analyt en matrixeffecten.
De eiwitprecipitatiestap werd uitgevoerd door acetonitril aan de plasmamonsters toe te voegen. Dit leidde tot de precipitatie van eiwitten en andere storende stoffen, terwijl het aan de warhead gebonden peptide en de interne standaard in het supernatant achterbleven. Het supernatant werd vervolgens in het LC–MS/MS-systeem geïnjecteerd, waar het aan de warhead gebonden peptide en de interne standaard (IS) werden gescheiden op een omgekeerde-fase C18-kolom met behulp van een gradiëntelutie van water en acetonitril, beide met 0,1% mierenzuur.
Detectie vond plaats met de massaspectrometer in de positieve elektrospray-ionisatiemodus (ESI+), waarbij gebruik werd gemaakt van multiple reaction monitoring (MRM) van de precursor- en productionen van het peptide dat aan de warhead is gekoppeld en van de interne standaard. De MRM-overgangen werden geoptimaliseerd om de hoogste gevoeligheid en specificiteit voor de analyt en de interne standaard te bereiken. De ontwikkelde workflow was ontworpen om een robuuste, reproduceerbare en gevoelige test te bieden die geschikt is voor peptidekwantificering bij meerdere diersoorten en om bioanalytische studies te ondersteunen bij zowel preklinische als klinische geneesmiddelenontwikkeling.
Resultaat
De LC–MS/MS-methode voor het peptide werd met succes gevalideerd volgens de richtlijnen van de Amerikaanse FDA voor de validatie van bioanalytische methoden. De test vertoonde uitstekende lineariteit, nauwkeurigheid, precisie, selectiviteit, gevoeligheid, terugvinding en stabiliteit voor het peptide dat aan de warhead is gekoppeld in plasma van ratten, niet-menselijke primaten en mensen.
De kalibratiecurven waren lineair over het concentratiebereik van 0,5–500 ng/mL, met correlatiecoëfficiënten groter dan 0,99. De nauwkeurigheid en precisie van de methode voldeden aan de acceptatiecriteria van ±15% voor de kwaliteitscontrolemonsters en ±20% voor de ondergrens van de peptidekwantificering. De selectiviteit van de methode werd aangetoond door de afwezigheid van enige significante interferentie van blanco plasmamonsters of plasmamonsters waaraan andere geneesmiddelen waren toegevoegd, inclusief matrices uit onderzoeken met niet-menselijke primaten.
De gevoeligheid van de methode was voldoende om het aan de warhead gebonden peptide te kwantificeren bij de ondergrens van kwantificatie van 0,5 ng/mL. De terugvinding was consistent en reproduceerbaar, met waarden variërend van 85% tot 95% voor het aan de warhead gebonden peptide en van 90% tot 100% voor de interne standaard. De stabiliteit werd bevestigd onder diverse opslag- en hanteringsomstandigheden, waaronder vries-dooicycli, korte- en langetermijnopslag en opslag na de preparatie, waarbij geen significante afbraak werd waargenomen.
De gevalideerde methode werd met succes toegepast ter ondersteuning van farmacokinetische studies in zowel preklinische als klinische omgevingen. De methode toonde haar bruikbaarheid en betrouwbaarheid aan voor de kwantificering van peptiden in plasmamonsters en leverde waardevolle informatie op voor de beoordeling van de veiligheid, werkzaamheid en farmacologische eigenschappen van het geneesmiddel. Bovendien bleek de experimentele LC–MS/MS-strategie een robuust platform te zijn voor de kwantitatieve analyse van peptiden, eiwitten en gerelateerde metabolieten, waardoor nauwkeurige en reproduceerbare resultaten werden gegarandeerd in alle onderzochte matrices.
Geregistreerd en geïnspecteerd door diverse regelgevende instanties
Neem contact op met onze wetenschapper over uw peptidekwantificering, peptide-LC-MS-analyse en peptide-PK
Gerelateerde artikelen
MSD-hybridisatie, ELISA, PK-immunoassayontwikkeling, GLP-validatie en oligonucleotideanalyse
TaqMan-genexpressietest, ontwikkeling van een test voor variatie in het aantal kopieën, nGLP-validatie en monsteranalyse
Analyse van genomische variatie – TaqMan-analyse van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen (SNP's)
LC-MS-bioanalyse van antisense-oligonucleotiden (ASO) met behulp van massaspectrometrie en ionenpaarchromatografie
LC-MS-analyse van epigallocatechinegallaat (EGCG) in VcEDTA-menselijk serum
LC-MS-methode voor het bepalen van het aminozuur proline en hydroxyproline in muizenweefsels
LC-MS-methode voor de analyse van DNA-adducten in celgebaseerde in-vitro-monsters
LC-MS-methode voor medicijnafgiftesystemen met everolimus-afgevende coronaire stents
Massaspectrometrie van aminozuren, kwantitatieve LC-MS-aminozuuranalyse
Ontwikkeling van een LC-MS-methode en GLP-validatie voor de analyse van PK-plasmamonsters
Test voor heranalyse van verzamelde monsters (ISR), FDA-vereisten en evaluatie van het onderzoek
Bemonstering van gedroogde bloedvlekken (DBS), verzameling van DBS en analyse van DBS
Uw partner op het gebied van kwaliteit, veiligheid en naleving
De life sciences-sector vereist gespecialiseerde kennis en betrouwbare ondersteuning. Met onze brede expertise helpen we organisaties om te voldoen aan wet- en regelgeving, kwaliteit te waarborgen en met vertrouwen te blijven innoveren.